Molecular Cancer|非小细胞癌研究成果新发现！
非小细胞肺癌（NSCLC）是一种肺癌患者占比最高的癌症，死亡率极高。长散在重复序列1（L1）属于一系列非长末端重复逆转录转座子，被证明与肺癌存在密切联系，而现有研究方法难以研究L1在改变肿瘤细胞代谢中的作用。近日，天津医科大学肿瘤医院于津浦课题组联合西奈山伊坎医学院在《Molecular Cancer》（IF:41.4）上发表了非小细胞肺癌最新研究成果《LINE-1 promotes tumorigenicity and exacerbates tumor progression via stimulating metabolism reprogramming in non-small cell lung cancer》，使用ReFuse（逆转录转座子基因融合估计程序）这一新型生物信息学方法，揭示了L1通过L1-FGGY嵌合转录本激活花生四烯酸代谢途径导致代谢重编程，从而刺激Wnt信号传导和其他致癌信号通路，加速肺癌发展。在本实验中，为了验证GPR31对细胞功能的影响，及其与泛素特异性蛋白酶USP24结合的可能性，作者使用汉恒生物提供的慢病毒进行了GPR31和USP24的敲低。
首先作者利用TCGA的RNA测序数据鉴定并量化了L1基因镶和转录本（LCTs），并发现肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）肿瘤样本中的LCT事件和表达显着增加。大多数LCT发生在剪接连接位点，暗示通过内膜L1启动子激活进行转剪可能是LCT形成的主要原因。
图1. 通过ReFuse识别LCT事件
对分析TCGA肿瘤样本RNASeq结果表明，L1活性与代谢过程、肿瘤基因组突变程度和肿瘤分期呈正相关，而与免疫反应、甲基化水平呈负相关。将肺小细胞癌患者组织的样本进行单细胞测序分析后，作者发现ReFuse从组织或单细胞RNAseq数据中检测到的LCT事件具有高度一致性，肿瘤细胞和上皮细胞中LCT事件更高，这些细胞中线粒体功能增加，核糖体生物发生和代谢途径活化。
图2. LCT与代谢、免疫过程和基因组不稳定性相关
图3. 非小细胞肺癌中单细胞水平的LCT活性变化
随后，作者选取具有差异表达和高频重复读取率的L1-FGGY进一步探索其潜在的致癌作用，对相关性较大的花生四烯酸（AA）代谢下游进行的表达分析显示，12-LOX和15-LOX表达明显上调，提示L1-FGGY通过AA代谢激活LOX途径。在NCI-H520中过表达L1-FGGY，发现AA代谢途径的富集，和12S-HETE（12-LOX下游代谢物）蛋白水平的升高。
图4. L1-FGGY启动花生四烯酸（AA）代谢重编程并激活12-LOX途径
接下来，作者进一步探索了147个LUSC肿瘤样本中参与LOX代谢途径的三种中心酶，观察到L1-FGGY+组织中12-LOX和15-LOX的表达增加，而仅12-LOX与患者生存率相关。患者组织中12-LOX和12S-HETE（12-LOX代谢产物）膜受体蛋白GPR31显著上调。在H520细胞中进行挽救实验也证明L1-FGGY对12-LOX及12S-HETE的正调控，并通过12-LOX通路促进H520细胞增殖和侵袭。
图5 L1-FGGY表现出致癌作用，依赖于12-LOX / GPR31代谢途径的激活。
为了探索参与L1-FGGY驱动癌症的信号通路，作者观察到Wnt信号相关基因——如Wnt3a、Wnt5a、p-GSK、p-JNK——在L1-GFFY+组织或过表达细胞中均显著上调，而这种过表达在12-LOX或GPR31被抑制时得到恢复。然而L1-FGGY过表达后GPR31的RNA水平无显著变化，蛋白表达却显著增加，作者提出泛素介导的蛋白质降解被L1-FGGY改变这一假设，并通过STRING分析发现泛素相关蛋白USP24。作者证实GPR31的泛素水平与L1−FGGY呈负相关，这种影响被USP24敲低抑制，免疫共沉淀实验显示USP24与FGGY或GPR31结合。最后，作者发现L1-FGGY降低了USP24的竞争性结合蛋白FGGY的表达，从而促进了USP24与GPR31的结合。
图6 L1-FGGY通过促进GPR31泛素化和增强12S-HETE/GPR31相互作用激活Wnt信号
为了探究L1-FGGY对体内肿瘤微环境的影响，作者进行了裸鼠成瘤实验，发现过表达L1-FGGY显著促进了肿瘤的增长，而逆转录酶和12-LOX表达的降低抑制了肿瘤生长。L1-FGGY的过表达在mRNA或蛋白水平上显著促进了12-LOX、Wnt相关蛋白、GRP31的表达，而抑制了FGGY表达；免疫细胞群的观察结果也显示L1-FGGY抑制CD3+ T细胞、CD8+ T细胞群和CD86+ DC细胞浸润，而抑制逆转录酶和12-LOX表达则会缓解甚至逆转这些变化。
图7 逆转录酶或12-LOX抑制剂抑制LUSC异种移植物生长，逆转体内免疫抑制微环境
总的来说，作者开发了一种基于局部比对的生物信息学工具，用于检测组织和单细胞RNA测序数据中对肺癌具有高敏感性的全基因组LCT，并发现了高度表达的L1-FGGY，揭示了L1-FGGY在肺癌致瘤性代谢编程中的功能作用——刺激AA途径和脂肪酸代谢的途径，从而影响Wnt信号传导和其他致癌信号通路，并影响体内肿瘤微环境。这一发现暗示了L1作为癌症诊断和预后的候选标志物，并为存在LCT的患者提供更有效的潜在癌症治疗策略。
