夏虫可语冰——浅谈细胞株构建阶段的稳定性研究
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“稳定”一词的定义是用来形容事物稳固安定，没有变动。药品“安全、有效、质量可控”的三要素投射到“稳定”的研究和考察上，被赋予了成为制药术语特色化的意义延伸。在整个大分子药物开发流程中，不止一次涉及“稳定性”相关研究内容。在CMC开发的起点——细胞株构建过程中，稳定性研究也作为一项重点内容，在单克隆评价中起了至关重要的作用。
细胞株构建阶段的稳定性研究指细胞株遗传稳定性研究，旨在前期研发筛选阶段通过模拟后期大规模生产代次、工艺或条件对候选单克隆细胞株进行评估，以探究并保证细胞株的可放大性及表达抗体质量。
CHO作为生物制药行业经典的哺乳动物蛋白表达系统，其来源及历史沿革已有众多文章进行了详尽的梳理和总结，在此不再赘述。作为染色体少于常见实验动物（最初报道CHO有22条染色体）的良好研究模型，相应CHO细胞的异质性也在业内具备普遍共识。有研究表明，在上世纪70年代，CHO细胞的某些亚克隆染色体已减少为21条甚至20条。除了染色体数目的变化，另有研究揭示，CHO细胞染色体也会自行发生交换及重排等现象。对于CHO细胞3号染色体上编码APRT、LDHA及GAA酶的基因进行考察，相对编码酶基因的位置在染色体上发生了倒置重排，形成了新的Z4染色体，如下图A所示；相邻的3号及4号染色体间也发现了基因重组交换现象，形成了新的Z3及Z7染色体。
FIGURE 1 Generation of three Z-chromosomes by rearrangements.
由此，有著名学者认为，由于CHO细胞具有非常强的异质性，可以认为其基因在不断传代中时刻处于动态变化的过程，因此没有真正意义上的“均一”的CHO细胞库。而CHO细胞的这一特性显然会给制药工艺过程及表达产物带来不确定性，与“可控”的目的背道而驰。因此，从质量控制的角度而言，细胞株的稳定性考察显得尤为重要，实际工作中，我们需要通过充分的研究，考察细胞株在生产窗口及工艺周期内，自身生长代谢是否有迹可循，表达产物是否均一可控。
与“稳定细胞株”中“稳定”是指相对瞬时表达而言的概念一致，细胞稳定性研究应当考察候选细胞株在模拟实际生产工艺及规模下的稳定性，包括细胞水平、基因水平以及蛋白水平。我们可以明确，对于细胞株的稳定性考察是有范围和区间的，而在早期细胞株构建阶段，评估细胞株稳定性使用原始细胞库（PCB）作为起点连续传代，达到覆盖未来商业化生产最大规模的代次。对于“代次”的界定，不同公司可能会有出入，私以为，以细胞倍增水平（PDL）计算细胞代次更能准确评估细胞稳定性。由于细胞为指数分裂形式，一次传代培养细胞PDL可以由以下公式计算：
连续传代过程中，细胞的实际PDL为传代PDL的累加，由此可规避使用传代次数计算由传代频率和时间带来的不确定性。在实际细胞株PCB稳定性评估开始时，实际生产的规模和工艺可能尚未敲定，因此，PCB常规稳定性考察一般模拟实际建库及扩种工艺，使细胞在含筛选压力或不含筛选压力的条件下传代60个PDL，计算60PDL的倍增水平足够覆盖20000L规模的生产代次。传代完成后，同时复苏PCB细胞（PDL定义为0）及传代终末细胞（一般为PDL60），在同样的条件下进行Fed-batch，细胞表达量升高或降低30%以内，并且表达蛋白质量未发生显著漂移，认为该细胞株稳定。通过多样化的单克隆筛选策略，可大幅提高通过细胞株遗传稳定性评估的单克隆。
皓越®细胞株开发平台单克隆稳定性分布
▲FIGURE 2 皓越®细胞株开发平台单克隆稳定性分布
（截至2022年）
值得一提的是，关于细胞株稳定性的评价，目前法规并未给出明确标准定义经过具体多少PDL的传代，或者细胞表达量的具体变化率，来规定某一细胞株的稳定性如何，仅要求开展细胞遗传稳定性研究，并强调遗传稳定性的规范性，如“传代稳定性研究应模拟实际生产条件(如扩增和生产阶段加压或不加压，传代周期、培养表达工艺条件等)、考察细胞水平、基因水平以及蛋白水平的稳定性，明确生产限传代次，特别需要注意的是上市申请时应评估已开展的传代稳定性研究能否满足商业化规模生产需求”。基于此，对于细胞株稳定性考察的现行业内通用做法和标准我们有更多的思考空间。由于行业技术水平的进步，细胞株表达量相较过去已大幅提升，就常规的批次补料生产方式而言，实际商业化批次生产规模是否还需要到达20000L？在质量可控的前提下，细胞株表达量变化超过了30%，是否一定意味着该细胞株不稳定？如此种种，值得我们重视思考和进一步的探讨，但无论如何，细胞株稳定性评价的目的是十分明确的。随着对宿主细胞研究的深入，技术的发展及评价手段的增加，立足于质量可控性，细胞株稳定性研究必将更加科学与全面，为后期的商业化生产情况予以更准确的提示，正是——可使夏虫语冰，而不拘于时也。
参考文献：
1、Maria J Wurm, Florian M Wurm. Naming CHO cells for bio-manufacturing: Genome plasticity and variant phenotypes of cell populations in bioreactors question the relevance of old names. Biotechnol J. 2021 Jul;16(7):e2100165.
2、Siciliano, M. J., Stallings, R. L., & Adair, G. M. (1985). The geneticmap of the Chinese hamster and the genetic consequences of chromosomal rearrangements in CHO cells. In: Gottesman, M. M. [ed] Molecular Cell Genetics, John Wiley and Sons. 95–135.
3、《生物技术药物研究开发和质量控制》（第三版），王军志主编，科学出版社
4、周莉婷，罗建辉.《生物制品上市申请药学申报资料常见问题和审评关注要点分析》. 《中国新药杂志》2020,29(03)：264-268.
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