今天介绍的病毒是浓核病毒(Densovirus)的典型代表——黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa Pefuambidensovirus，Periplaneta fuliginosa Densovirus，PfDNV)。

简介

        黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa Pefuambidensovirus，Periplaneta fuliginosa Densovirus，PfDNV)是细小病毒科双义浓核病毒属(Ambidensovirus)中黑胸大蠊浓核病毒(Pefuambidensovirus)的唯一成员。

       PfDNV由胡远扬等人从死亡的黑胸大蠊体内分离，并于1991年首次对该病毒进行了报道，使其成为世界上第一个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。

       PfDNV可以高效、特异的杀灭黑胸大蠊，因此具有作为生物杀虫剂的能力。

病毒学特征

        PfDNV体积小，直径为18~26纳米，无包膜。病毒粒子为二十面体，三角对称数T=1。在病毒粒子中有60个外壳蛋白拷贝。每个复制品都有一个被描述为“风筝形楔子”的形状，表面表面粗糙，有许多小突起。病毒粒子似乎不含脂质。

       PfDNV表面较光滑、三重轴上存在小刺状突起而无钉状突起；五重轴上没有五重轴通道，亦没有峡谷区，但有类似于三重轴上的小刺状结构；两重轴上存在酒窝样凹陷，这些结构不存在于其他细小病毒中。

      PfDNV是双义的DNA病毒，其正义链与反义链分别编码非结构蛋白(NS)和衣壳蛋白(VP)。病毒粒子由60个衣壳蛋白亚基呈正二十面体对称排列。衣壳蛋白具有保护病毒基因组、识别细胞表面受体、决定宿主特异性等功能。

       PfDNV末端序列存在201nt的倒置重复序列

(ITRs)。同时，病毒基因组两末端均存在122nt的回文序列，但PfDNV的末端回文序列中不存在小的回文序列，不能形成“Y”或“T”型结构，而是形成典型的棒状发夹结构。在细小病毒基因组中，末端发夹结构与病毒的复制有密切的关系。可由此推测PfDNV的复制采取“自身引物，发夹转移“的方式，首先以折叠的3端回文序列为引物合成病毒DNA中间体，最后通过特异性位点的切割而得到子代病毒DNA。

       黑胸大蠊浓核病毒基因组反义链编码衣壳蛋白(VP)。病毒感染黑胸大蠊后其VP mRNAs经由可变剪接产生。

       SDS-PAGE分析显示病毒衣壳中含有五个衣壳蛋白，105kDa(VP5)、82kDa(VP4)、79kDa(VP3)、56kDa(VP2)、52kDa(VP1)。而对其VPmRNAs的序列分析显示它们可编码产生大小为52kDa(VP52)、65kDa(VP65)、85kDa(VP85)的三个候选衣壳蛋白。因此推测产生衣壳蛋白的数目与SDS-PAGE结果不一致。

         为了确定由mRNAs序列分析得出的VP52、VP65、VP85与SDS-PAGE显示的VP1-5间的关系，人们用含病毒基因组的重组质粒pUC119-PfDNV转染黑胸大蠊幼虫获得VP mRNAs后将所得VP52、VP65、VP85蛋白的开放阅读框(ORF)克隆入真核表达载体，利用杆状病毒表达系统，表达相应蛋白。在获得VPmRNAs的过程中，在已知的剪接供体位点sd1、sd2、sd3和剪接受体位点sa1、sa2、sa3的基础上，我们发现了额外的剪接供体位点sd4、sd5和剪接受体位点sa4;并在已知的五种PfDNV VP mRNAs

(sd1sa1&sd2sa2，sd1sal&sd2sa3，sd1sa1&sd3sa3，sd3sa3及未剪接VP mRNA)的基础上另外发现了三种VPmRNAs(sd4sa1&sd2sa2，sd4sal&sd3sa3，sd1sa1&sd5sa4)。

       非常有趣的是，这三个新VP mRNAs无编码新的候选衣壳蛋白的能力，即所有VP mRNAs仍只编码产生VP52、VP65、VP85。通过表达的VP52、VP65、VP85蛋白与病毒粒子衣壳蛋白的western blot比较，VP52即VP2，VP65即VP3与VP4，VP85即VP5，我们认为VP1是VP2(VP52)在病毒成熟后的N端水解产物。进一步研究发现在6%SDS-PAGE电泳后western blot检测时，VP3与VP4(VP65)显示出四条带；在VP65N端加入Flag标签、C端加入His标签后检测时仍为四条带，表明它们并非由VP65表达过程中N端降解或C端提前终止产生；因此VP65存在翻译后修饰。对病毒粒子的酪氨酸磷酸化检测结果表明，PfDNV VP蛋白存在酪氨酸磷酸化修饰；其中VP1的酪氨酸磷酸化最强，VP2(VP52)、VP3与VP4(VP65)的酪氨酸磷酸化较弱，VP5未检测到磷酸化信号；然而在用去酪氨酸磷酸化酶(PTP)及去丝氨酸、苏氨酸磷酸化酶（Lambda PP)处理时，真核表达的VP65的带型并未改变，因此酪氨酸磷酸化并不是导致四条带产生的原因。此外，对病毒粒子的泛素化检测无信号，结合上述实验结果我们推测还有其他类型的翻译后修饰形式存在。由于VP52的序列完全位于VP65内并且相同表达条件时VP52只有一条带，因此我们认为导致VP65产生四条带的修饰位置在其独有的N端113个氨基酸上。

        由于直接利用PfDNV病毒粒子进行各衣壳蛋白功能研究的可操作性较低，因此，在真核细胞中成功表达了VP52、VP65、VP85蛋白，并确定它们为PfDNV衣壳蛋白后，人们进一步研究了VP52、VP65、VP85蛋白在Sf9细胞中的分布及包装情况。通过间接免疫荧光及分离细胞核、质组分进行westernblot的方法，我们发现VP52、VP65、VP85单独在Sf9中表达时均可进入细胞核；此外在VP65N端加入Flag标签或C端加入His标签或N端加入Flag标签的同时C端加入His标签时，都不影响VP65的核定位。通过PSORTII软件分析发现VP52、VP65、VP85含有可能的共同核定位序列PPNKKAKT。为确定该序列是否有决定VP入核的功能，我们研究了一系列N端缺失的VP65蛋白的分布情况。实验结果表明缺失VP65N端242个氨基酸时不影响其在细胞内的分布。因预测的核定位序列PNKKAKT位于VP65的143-150位，因此表明该序列不具备核定位功能。此外，人们还研究了缺失C端100个氨基酸的VP65的分布情况，实验结果表明缺失C端100个氨基酸时亦不影响VP65的分布。由此人们推测PfDNV VP上不存在典型的核定位信号，VP入核可能依靠其自身空间结构上的信息或细胞因子的辅助作用。人们在确定PfDNV VP可以入核后进一步研究了这些入核的VP是否能够包装并最终形成病毒粒子。实验结果表明，VP52、VP65、VP85单独存在时都可以形成蛋白聚集体，而VP52、VP65单独表达时皆可形成病毒类似粒子，VP85则不能。由此，人们认为VP85不是病毒包装所必需的。VP52、VP65、VP85混合表达时也可形成病毒类似粒子，并且所形成的病毒类似粒子似乎更接近于野生型病毒粒子。

病毒生活史

        浓核病毒在宿主细胞核内复制、包装。

1.附着到宿主受体开始网格蛋白介导的病毒粒子内吞进入宿主细胞。

2.病毒粒子通过宿主内体膜渗透进入细胞质。

3.病毒粒子向细胞核的微管运输。

4.病毒ssDNA基因组进入细胞核。

5.ssDNA通过细胞蛋白质转化为dsDNA。

6.当宿主细胞进入S期时，dsDNA转录产生病毒mrna，并翻译产生病毒蛋白。

7.通过滚叉复制进行复制，NS1内切酶共价结合到5'基因组末端。

8.单个ssDNA基因组从复制串联体中被切除的过程称为连接分辨。

9.这些新合成的ssDNA也可以：

A)转换为dsDNA，作为转录/复制的模板

B)被包被形成新的病毒粒子，并通过细胞裂解而释放。