外泌体small RNA文库风险早知道
一、 miRNA高通量测序
随着高通量测序技术的普及， miRNA的高通量测序也成为一种常规技术。众所周知miRNA是存在于各个物种中的一种非编码的小RNA，参与调控细胞内三分之一以上的基因表达，是基因表达调控网络的重要组成部分。后来人们又发现外泌体中的miRNA同样对生物体具有重要作用，因此掀起了外泌体miRNA研究的热潮。外泌体是广泛存在于各种体液中的一种直径为30-150nm的具有双层膜结构的生物活性囊泡，透射电镜下观察呈杯状（图1），它携带了分泌细胞包含的生物活性物质，如DNA、miRNAs、mRNA、长链非编码 RNA（LncRNA）、酶、蛋白质和细胞代谢物等。几乎所有类型的细胞都能产生并释放外泌体，这些外泌体既能在血液等体液内传播，最后又能被其他细胞吞噬，所以外泌体在细胞间通信中扮演着十分重要的角色。目前对于外泌体的研究涉及包括肿瘤的发生发展、侵袭转移机制、肿瘤诊断标志物以及药物传递系统等诸多方面。在外泌体的研究中，miRNA是目前报道最多的成分之一。
上海欧易作为较早提供外泌体miRNA建库测序服务的公司之一，在外泌体miRNA建库方面积累了大量的项目经验，本文将大致介绍我们在外泌体miRNA建库项目中遇到的一些情况，供老师研究外泌体miRNA参考。
图1. 透射电镜下的外泌体
二、 外泌体RNA的量
外泌体的来源有很多，但大致可分为组织样本、体液样本和细胞上清三类。本文不对组织样本提取外泌体进行讨论，只涉及体液和细胞上清样本。体液样本包含了血清血浆、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、眼泪、腹水等等。除尿液外，其他体液一般能获得的体积相对较少。因此抽提得到的RNA量也比较少。在《少量核酸浓度测定的小知识》一文中对这类RNA的定量及其准确性做过相关介绍。除体液外，细胞上清是研究得非常多的样本，由于获得难度相对较小，能得到较多的RNA进行后续实验。在我们的项目经验中，细胞上清来源的外泌体抽提得到的总RNA能达到几十微克甚至更多，但是有的只得到皮克级的总RNA量。这与细胞上清的体积、细胞培养方式、细胞本身分泌外泌体的能力等因素都有关系。
三、 miRNA文库条带与片段分布
1. 正常样本的miRNA文库条带与片段分布
一般正常样本的miRNA文库，Bioanalyzer 2100质检时可见文库峰图主峰在147nt附近之间（图2）（147nt-157nt是Illumina 小RNA建库试剂盒给出的参考值，其它建库试剂盒的建库大小参考各家的说明书），对此文库的测序结果进行数据分析，会发现文库片段长度分布图的主峰在20-24nt之间，大部分动物样本的最高峰是22nt（图3）。
图2 正常样本miRNA文库质检峰图
图3 正常miRNA文库的片段分布
2. 特殊样本miRNA文库条带与片段分布
用外泌体来源的RNA建库，经常会遇到文库条带大小不符合预期的情况，主峰偏大或偏小都有可能。我们发现，Bioanalyzer 2100质检的文库条带大小往往跟数据分析结果的片段分布有一定的对应关系，例如当文库主峰小于147nt时（图4），数据分析结果的片段分布一般会出现大量小片段（图5）。
图4 外泌体样本miRNA文库质检峰图
图5 外泌体miRNA文库的片段分布
有的样本miRNA文库质检时条带虽然偏小（图6），但是测序数据分析结果显示小片段偏多的同时，也会含有一些大于30nt的片段（图7）。当然，文库主峰偏小可能还会出现其它片段分布情况，在此就不一一列举。另外根据经验，这种文库偏小的情况在细胞上清样本出现概率相对高一些。
图6 外泌体样本miRNA文库质检峰图
图7 外泌体miRNA文库的片段分布
文库质检主峰偏大的情况在外泌体RNA建库项目中也比较常见。当建库条带偏大时，数据中经常出现大量大于30nt的片段，经过序列分析发现这种分子大部分是tRNA或piRNA。如图8，图9所示。
图8 外泌体样本miRNA文库质检峰图
图9 外泌体miRNA文库的片段分布
还有的样本miRNA文库条带接近160nt，片段分布结果显示有大量的大于35nt的序列存在。外泌体样本RNA与组织样本RNA的另一个区别是组织RNA建small RNA文库的片段主峰是147nt或偏离147稍微大一些的值，则文库片段分布很可能是正常的。但是外泌体RNA样本文库主峰是偏离147稍微大一些的值，则其片段分布异常的可能性却比较高。
四、结论
外泌体来源的RNA样本建small RNA文库出现小片段或大片段含量丰富的的概率偏高，而且即使文库质检的峰值类似，也不代表片段分布会完全一致，这也是我们只能提示实验有风险但却很难给出准确风险的原因。不过这种片段分布异常的数据并非不可用，只能说由于外泌体中的片段成分比较多，文库结果依旧能够相对客观的反应样本的实际情况。遇到这种情况先不要着急，毕竟杂带多并不代表目的条带不在了，目的条带仍然在，只是含量少，我们需要解决的是如何让项目数据为课题服务挖掘出有用的信息。在现有技术水平及具体样本下，得到有用的结果才是根本。当然，不断提升实验技术水平也是我们非常重要的任务，让客户满意是每个欧易人的追求。
