嘌呤霉素筛选

嘌呤霉素筛选的用途

Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基糖苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选能够表达pac基因的细胞。pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果表达该基因，就会对嘌呤霉素产生抗性。这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前，很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为 puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。

Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。

嘌呤霉素筛选的机制

嘌呤霉素是真核和原核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂，其作用机制图如下。嘌呤霉素通过模拟氨酰化tRNA(aa-tRNA) 的3'末端，代替正常氨基酸参与翻译延长过程。它通过核糖体肽基转移酶中心(PTC)催化掺入新生链的C末端，阻止进一步延伸，导致翻译过早的终止，从而抑制了蛋白质合成，造成细胞死亡。

推荐工作浓度

推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/mL，但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。

嘌呤霉素筛选的方法

01、将Puromycin按所需工作浓度添加到培养基中，用于待筛选细胞的培养；

02、逐步筛选：pac基因转染48h后，用含有终浓度为2μg/mL的Puromycin的培养基换液；

03、传代时，逐步增加Puromycin的浓度，筛选稳定转导的细胞株。推荐按照2/4/6/8/10的梯度逐渐增加Puromycin用量；

04、筛选过程中，建议不要使用细胞做实验，抗生素会影响部分实验结果。

嘌呤霉素维持的方法

1、定期筛选：连续培养的细胞筛选频率为1-2个月，筛选时，将嘌呤霉素直接添加到培养基中，细胞正常培养传代即可，每次筛选时间为一周，嘌呤霉素终浓度为4μg/mL；

2、长期冻存的细胞，复苏后第二代待细胞状态稳定时，可进行筛选，维持阳性细胞比例。