TTRIM32/USP11平衡了ARID1A的稳定性和鳞状细胞癌的致癌抑癌状态

写在前面

        今天推荐的是由中国医学科学院中国协和医科大学在2020年1月7日发表于Cell Reports（2020IF：9.4233，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Zhihua Liu教授，研究表明TTRIM32/USP11平衡了ARID1A的稳定性和鳞状细胞癌的致癌/抑癌状态。

研究背景

        鳞状细胞癌 (SCC) 是一种侵袭性上皮恶性肿瘤，但SCC发展的分子机制尚不清楚。ARID1A在各种癌症类型中经常发生突变，然而ARID1A的突变率和表达水平在SCC中普遍较低。

摘要部分

        在这里，作者揭示了泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的过度蛋白质降解导致SCC中ARID1A表达的丧失。作者发现E3连接酶TRIM32和去泛素化酶USP11在控制ARID1A稳定性方面起着关键作用。TRIM32敲低通过稳定ARID1A来抑制SCC细胞增殖、转移和化学抗性，而USP11敲低通过促进ARID1A降解来促进SCC发展。作者表明，syndecan-2 (SDC2) 是ARID1A和USP11的下游靶标，并且SDC2敲低消除了ARID1A缺失导致的致癌功能。总之，作者的数据揭示了UPS介导的蛋白质降解是ARID1A缺失的潜在机制，并提出了TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2轴在SCC中的重要作用。

研究内容

1.ARID1A主要在C端被UPS修饰

        为了评估ARID1A是否在SCC的发展中起重要作用，作者进行了IHC分析以检测SCC病例中的ARID1A表达水平。分析表明，ARID1A表达水平低的SCC患者预后较差。为了研究ARID1A是否可以被SCC细胞中的UPS调节，作者用蛋白酶体抑制剂MG132处理了SCC细胞。MG132处理后ARID1A的蛋白水平显着升高。qRT-PCR测定证实ARID1A的 mRNA 表达水平在MG132处理后没有变化。脉冲追踪分析表明，ARID1A蛋白在人食管上皮细胞系NE2和NE3中比在SCC细胞系中更稳定。这些结果表明，ARID1A稳定性由SCC细胞中的UPS控制。为了确定ARID1A的调控区域，作者根据ARID1A的域构建了四个缺失突变体，实验结果表明，A3和A4的表达水平在MG132处理后明显积累，表明ARID1A主要受C端UPS的调控。为了鉴定ARID1A中泛素化修饰的特定赖氨酸位点，FLAG-ARID1A和血凝素-泛素 (HA-Ub) 在293T细胞中共表达，并且对被抗FLAG珠子拉下的免疫沉淀物进行质谱 (MS) 分析泛素化位点。检测到8个泛素化赖氨酸位点，其中3个位于A3，2个分布在A4。考虑到A3和A4是UPS调控的主要区域，作者推测 K1830、K1934、K1961、K2124和 K2243可能是负责泛素化的关键位点。为了验证作者的假设，所有五个赖氨酸位点都突变为精氨酸，命名为ARID1A5KR。与作者的推测一致，突变体ARID1A5KR几乎失去了被泛素化的能力。为了确定调节ARID1A稳定性的关键E3连接酶和DUB，使用MS分析评估了FLAG-ARID1A相关蛋白，并显示五个E3连接酶和四个DUB与ARID1A相互作用。

研究结论：RID1A受SCC中UPS的调控。

2.E3连接酶TRIM32与ARID1A相互作用并泛素化以促进其降解     

        作者接下来选择了与ARID1A显着相关的四种E3连接酶用于进一步研究。免疫印迹 (IB) 表明，只有靶向TRIM32的shRNA序列对增加ARID1A蛋白表达水平具有稳定且显着的影响，而不影响ARID1A mRNA 表达水平。作者发现野生型TRIM32的异位表达，而不是DR突变体的异位表达，以剂量依赖性方式降低内源性ARID1A蛋白，但不降低mRNA水平。脉冲追踪分析表明，TRIM32敲低显着延长了KYSE30细胞中ARID1A蛋白的半衰期。相比之下，KYSE410 细胞中TRIM32的过表达加速了ARID1A的降解。

        为了研究TRIM32在调节ARID1A中的作用，作者进行了共免疫沉淀 (coIP) 分析，其中将FLAG-ARID1A和Myc-TRIM32共转染到293T细胞中。在使用抗FLAG磁珠进行免疫沉淀 (IP) 后，检测到Myc-TRIM32，反之亦然。接下来，作者绘制了ARID1A与TRIM32相互作用的区域，结果显示A2、A3和A4与这种相互作用有关。作者进一步实验表明只有包含RING结构域的全长TRIM32才能显着促进ARID1A泛素化。泛素化分析表明，当K2124突变为精氨酸时，TRIM32对ARID1A的影响就消失了。因此，TRIM32增加了ARID1A的野生型和4种突变型的不稳定性，但不会增加ARID1A K2124R 的不稳定性。这些结果表明，TRIM32主要通过泛素化第2,124位赖氨酸位点来促进ARID1A的降解。

研究结论：E3连接酶TRIM32与ARID1A相互作用并泛素化以促进其降解。

3.TRIM32通过降解ARID1A促进SCC增殖和化学抗性

        为了研究TRIM32在SCC中的功能，作者首先敲低了KYSE180和NCI-H596细胞中的TRIM32。CCK-8细胞活力测定表明，TRIM32敲低显着抑制细胞增殖并增加其对顺铂 (DDP) 治疗的敏感性。为了验证TRIM32敲低的肿瘤抑制功能是由ARID1A表达增加介导的，作者在表达靶向TRIM32的shRNA的KYSE30细胞中敲低了ARID1A。CCK-8和EdU染色测定均表明ARID1A缺失消除了TRIM32敲低的肿瘤抑制功能。此外，如CCK-8和annxin V/PI双染色检测所检测到的，ARID1A缺失回补了TRIM32敲低的KYSE30细胞对 DDP处理而增加的化学敏感性。一致地，Transwell 测定表明TRIM32敲低抑制SCC细胞迁移和侵袭。接下来，作者试图验证TRIM32及其酶活性的致癌功能。野生型或DR突变型不同SSC细胞中稳定过表达，只有野生型TRIM32对降低ARID1A表达有明显影响。因此，CCK-8 细胞活力和Transwell测定表明野生型TRIM32促进SCC细胞增殖、化学抗性、迁移和侵袭，而DR突变体TRIM32没有显示出明显的致癌功能。为了证实TRIM32在体内的致癌功能，使用表达靶向TRIM32的shRNA的KYSE30和KYSE410细胞进行异种移植实验。TRIM32敲低不仅显着抑制了盐水治疗组的肿瘤生长，而且还增加了肿瘤对DDP的敏感性。ARID1A的进一步敲低恢复了由TRIM32损失引起的影响。然而，升高的TRIM32水平显着促进了体内KYSE410细胞的生长和化学抗性，并且ARID1A的过表达逆转了这种效果。

研究结论：TRIM32的过表达通过下调ARID1A蛋白表达加速SCC的进展。

4.USP11与ARID1A相互作用并使其去泛素化

        MS分析表明ARID1A和USP11或USP39之间存在特异性相互作用或。作者用shRNA序列敲低了KYSE30细胞中USP11或USP39的表达，IB结果显示，USP11敲低后，ARID1A表达显着降低，但USP39敲低未显示ARID1A的明显下调。脉冲追踪分析还表明，USP11而非USP11 C318A（无酶活突变体）的过表达显着延长了KYSE30细胞中内源性ARID1A的半衰期。一致地，表达靶向USP11的 shRNA的KYSE410细胞中的ARID1A蛋白比表达对照shRNA的细胞中的蛋白明显更不稳定。接下来，作者试图探索USP11是否充当ARID1A的真正去泛素化酶。coIP 分析表明ARID1A和USP11可以直接相互结合。作者随后进行了泛素化分析以验证USP11对ARID1A的酶促调节。结果表明，野生型USP11可以显着去除ARID1A上修饰的泛素链，但USP11 C318A失去了这种能力。为了确定ARID1A上去泛素化事件的位点，作者分别将 K1830、K1934和 K1961突变为精氨酸。泛素化分析显示ARID1A K1961R不能被USP11去泛素化，说明第1,961个赖氨酸位点负责这种去泛素化。脉冲追踪分析也证实K1961是介导USP11在ARID1A上稳定的重要位点。

研究结论：USP11与ARID1A相互作用并使其去泛素化。

5.USP11通过稳定ARID1A防止SCC增殖和转移

        为了验证USP11在SCC中的作用，作者在NCI-H596细胞中过表达野生型和突变型USP11，发现野生型USP11的过表达显着增加了ARID1A蛋白水平。CCK-8细胞活力测定显示野生型USP11的过表达显着抑制 NCI-H596细胞的增殖。野生型USP11的过表达也增加了NCI-H596细胞对DDP处理的敏感性，而突变型USP11的过表达则没有这种影响。因此，Transwell和伤口愈合试验表明野生型USP11可以抑制NCI-H596细胞迁移和侵袭。为了验证USP11的肿瘤抑制功能依赖于ARID1A，作者敲低了USP11过表达KYSE30细胞中的ARID1A，结果显示ARID1A缺失消除了USP11在KYSE30细胞中的肿瘤抑制功能。体内转移实验还表明USP11抑制SCC细胞转移，并且可以通过ARID1A敲低来回补。接下来，作者在KYSE410和YES2细胞中敲低USP11，然后过表达ARID1A。USP11敲低显着促进SCC细胞的增殖、化学抗性、迁移和侵袭，而ARID1A异位表达减少了USP11耗竭引起的致癌作用。

研究结论：USP11敲低通过促进ARID1A降解来促进SCC进展，即USP11通过稳定ARID1A抑制SCC的发展。

6.核TRIM32和USP11表达与SCC细胞系和患者样本中的ARID1A表达相关

        之前研究表明TRIM32和USP11对ARID1A蛋白质稳定性具有强的调节作用，作者接下来试图验证这三种蛋白质在SCC细胞和样品中表达的相关性。TRIM32和USP11均在SCC细胞的细胞核和细胞质中表达，但其底物ARID1A仅在细胞核中表达和发挥功能；因此，作者检查了三种蛋白的核表达水平。IB结果显示核TRIM32表达水平与ARID1A蛋白水平呈负相关，而核USP11表达水平与ARID1A表达水平呈正相关。IHC分析还显示，核ARID1A和TRIM32之间以及ARID1A和USP11之间分别存在显着的负相关和正相关。进一步的分析表明，TRIM32的高表达水平与不良预后、转移和晚期病理分期相关，表明它是SCC中的关键癌基因，并有可能成为治疗靶点。相比之下，高USP11表达水平与良好的预后相关，尽管它与其他临床变量没有显着相关性。

研究结论：TRIM32和USP11与SCC中的ARID1A表达相关。

7.ARID1A不稳定性激活SDC2和致癌信号

        为了研究由TRIM32过表达或USP11敲低引起的ARID1A不稳定性如何促进SCC发展的潜在机制，作者进行了RNA测序（RNA-seq）测定。有33个基因在ARID1A敲低和USP11敲低细胞中显着上调。数据库富集分析表明，细胞粘附分子 (CAM) 构成了ARID1A或USP11敲低后显着上调基因或33个重叠基因的最高富集基因组之一。在重叠基因中，作者专注于SDC2，一种跨膜（I 型）硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。已在多种癌症类型中检测到SDC2表达的改变，SDC2被认为是SCC的诊断标志物。qRT-PCR实验证实了ARID1A敲低时SDC2的激活和ARID1A过度表达时SDC2的抑制。作者接下来进行了ChIP分析以研究ARID1A对SDC2的调控机制。结果表明，ARID1A敲低导致ARID1A与SDC2启动子区域之间的分离，并导致Rbp1与SDC2启动子区域之间的关联增强。此外，在ARID1A敲低后，Brg1和SDC2启动子区域之间的关联降低。表明ARID1A缺失通过染色质重塑介导的基因激活在转录水平激活SDC2表达。IB还显示USP11和ARID1A过表达均抑制SDC2表达，以减少通过PI3K/Akt、MAPK和 Wnt等通路的致癌信号传导。作者还发现SDC2的敲低削弱了ARID1A/USP11敲低或TRIM32过表达引起的增殖、化疗抵抗、迁移和入侵的增加。据报道，SDC2选择性地结合血管内皮生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF) 和表皮生长因子 (EGF)；因此，作者接下来研究了这些细胞因子是否可以激活SDC2介导的致癌信号。作者处理了表达异位ARID1A、USP11或靶向TRIM32的 shRNA的KYSE30细胞，发现这些细胞因子可以通过USP11过表达或TRIM32敲低来消除ARID1A表达升高的抑制功能。此外，VEGF、FGF和EGF处理重新激活了由ARID1A或USP11过表达引起的抑制致癌信号。

研究结论：ARID1A不稳定性激活SDC2和致癌信号。

8.TRIM32/USP11平衡ARID1A稳定性并影响SCC的干性、肿瘤发生和化学抗性

        为了研究由TRIM32/USP11控制的ARID1A稳定性平衡的SCC细胞的致癌/肿瘤抑制状态，作者在KYSE180细胞中过表达TRIM32、USP11或ARID1A以评估它们的功能。TRIM32的过表达降低了 KYSE180 细胞中ARID1A的表达水平，而USP11的过表达增加了ARID1A蛋白的表达水平。IB分析显示TRIM32过表达促进SDC2表达和Akt、Erk1/2和 LRP6的磷酸化，表明致癌信号被激活。相比之下，USP11和ARID1A的过表达通过抑制SDC2来抑制这些途径。作者接下来进行了IB以检测表达TRIM32、USP11或ARID1A的 KYSE180 细胞中的几种干细胞和分化标志物。TRIM32过表达显着增加了干性标志物 SOX2和NANOG的表达水平，并降低了分化标志物角蛋白4和角蛋白13。然而，USP11和ARID1A的过表达降低了干性标记的表达并增加了分化标记的表达。一致地，TRIM32过表达阻止了细胞凋亡，而USP11和ARID1A过表达促进了KYSE180细胞对DDP处理的敏感性，TUNEL和IB分析表明。克隆形成试验和球体形成试验表明也是同样的趋势。然而，USP11或ARID1A的过表达降低了细胞的集落形成和球体形成能力。为了评估TRIM32/USP11控制的ARID1A在肿瘤起始中的作用，作者进行了体内肿瘤形成试验，其中表达异位TRIM32、USP11或ARID1A的KYSE180细胞数量增加被异种移植到NCG小鼠中。结果发现TRIM32促进肿瘤形成，而USP11/ARID1A在体内抑制KYSE180细胞的肿瘤形成能力。

研究结论：TRIM32和USP11控制ARID1A稳定性以维持SCC细胞的致癌/肿瘤抑制状态。

结论与讨论

        使用RNA-seq分析，作者发现SDC2是ARID1A缺失后的下游目标。机制研究表明,ARID1A缺失通过染色质重塑转录激活SDC2，其中SWISNF复合物中的结构变化使SDC2的转录激活增强。作者发现SDC2激活致癌信号，如PI3K/Akt、Ras/MAPK和Wnt/LRP6信号通路，以促进SCC的发生和进展。作者的研究结果表明, TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2轴对SCCs的进展至关重要这一发现为靶向TRIM32或SDC2治疗ARID1A表达水平低的SCc病例提供了一个潜在的策略。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.12.017