去泛素化酶USP21通过下调Tat表达抑制HIV-1复制

写在前面

        今天推荐的是由吉林大学第一医院在2021年6月10日发表于Journal of Virology（2020IF：5.103，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Wenyan Zhang教授，研究表明去泛素化酶USP21通过下调Tat表达抑制HIV-1复制。

研究背景

        泛素化在人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染中起重要作用。HIV蛋白如Vif和Vpx分别通过蛋白酶体途径介导宿主蛋白APOBEC3和SAMHD1的降解。然而，去泛素化酶是否在HIV-1感染中起重要作用尚不清楚。

摘要部分

        在这里，作者证明去泛素化酶USP21通过间接下调HIV-1转录激活因子(Tat)的表达有效抑制HIV-1的产生，这对于HIV-1中的转录延伸至关重要。USP21通过其去泛素化酶活性去泛素化Tat。进一步研究表明，USP21通过增加细胞周期蛋白T1启动子中组蛋白K9的甲基化来下调细胞周期蛋白T1 mRNA水平，细胞周期蛋白T1是与Tat和反式激活反应元件(TAR)相互作用的正转录延伸因子b(P-TEFb)的亚基，并且是转录刺激和Tat稳定性所需。此外，USP21对其他HIV-1辅助蛋白的功能没有影响，包括Vif、Vpr、Vpx和Vpu，表明USP21对Tat具有特异性。这些发现提高了我们对USP21介导的HIV-1产生功能抑制的理解。

研究内容

1.USP21有效抑制HIV-1的产生       

        由于UPS在HIV-1感染中的重要作用，作者筛选了一些DUB USP对HIV-1复制的影响。为了确定USP是否抑制HIV-1复制，作者检查了一系列USP的抗HIV-1能力。作者发现当TZM-bl细胞用作感染指示细胞时，在USP21存在下感染性HIV-1的产生大大降低，而USP10、USP13、USP20等适度影响HIV-1产量。其他USP成员没有显示效果。USP和Gagp55的水平通过免疫印迹(IB)分析确定。USP21也明显降低细胞内Gagp55的表达。

        随着USP21剂量的增加，细胞裂解液和病毒上清液中Gagp55和CAp24的表达，以及感染性HIV-1产量，以剂量依赖性方式下降，进一步证实USP21抑制HIV-1的产生。相比之下，与阴性对照shRNANC相比，HEK293T细胞中 sh-USP21的稳定敲低导致细胞裂解物中Gagp55和病毒上清液中CAp24的水平增加。USP21 shRNA细胞上清液中感染性HIV-1的产生增加了大约2倍。为了进一步确定目标T细胞中感染性HIV-1的产生是否随时间受到USP21的影响，作者使用靶向USP21和shRNA NC的shRNA构建了稳定的USP21敲低Jurkat细胞。与第2天Jurkat细胞中的shRNA NC相比，敲除USP21诱导感染性HIV-1的产量增加了大约1.5倍，并且这种感染性HIV-1的产量一直保持到第6天。通过IB分析证实了Jurkat细胞中的USP21敲低。

研究结论：USP21以剂量依赖性方式有效抑制HIV-1的产生。

2.USP21对HIV辅助蛋白（Vif、Vpx、Vpr和Vpu）的功能没有影响

        USP21是一种去泛素化酶，可从靶蛋白中去除多聚泛素化。HIV辅助蛋白Vif、Vpx和Vpr募集宿主E3泛素连接酶复合物以诱导宿主限制因子A3G、SAMHD1和HLTF的多泛素化，而Vpu参与BST-2降解通过蛋白酶体或溶酶体途径。因此，作者试图确定USP21是否会导致泛素化A3G、SAMHD1、HLTF或BST-2的去泛素化，以保护宿主因子免于降解并导致HIV抑制。作者首先检查了USP21的过表达或敲低是否会影响Vif对A3G的降解。数据显示USP21对Vif介导的A3G降解没有影响。作者还观察到，增加USP21的量对Vpx介导的SAMHD1、Vpr介导的HLTF或Vpu介导的BST-2降解没有影响，表明USP21对HIV-1的抑制与HIV-1辅助蛋白的功能不相干。为了检查USP21介导的HIV-1生成减少是否与蛋白酶体或溶酶体降解途径相关，将HIV-1野生型(WT)、USP21或对照载体VR1012共转染到HEK293T细胞中。细胞中加入不同的抑制剂，包括蛋白酶体抑制剂MG132、NEDD8激活酶(NAE)抑制剂MLN4924和自噬溶酶体抑制剂氯化铵。这些抑制剂没有恢复USP21对HIV-1产生的抑制作用。

研究结论：USP21介导的HIV-1感染性调节不是由于从宿主因子A3G、SAMHD1、HLTF和BST-2中去除了多聚泛素化并促进了它们的表达。不仅如此，USP21介导的HIV-1感染性与蛋白酶体和溶酶体途径也没有关系。

3.USP21通过减少Tat表达来特异性抑制Tat介导的HIV-1 LTR反式激活

        HIV-1 LTR驱动HIV-1转录本的转录起始和延伸。Tat与所有病毒转录本第59末端的TAR元件相互作用并刺激转录延伸。为了检查在有无Tat的情况下USP21对HIV-1 LTR反式激活的影响，作者使用荧光素酶报告系统来检测HIV-1 LTR和CMV启动子活性。在没有Tat的情况下，USP21对HIV-1 LTR活性有轻微的抑制作用。在Tat存在下，HIV-1 LTR反式激活被显着激活，而USP21以剂量依赖性方式显着抑制Tat驱动的荧光素酶活性。有趣的是，作者观察到USP21也降低了Tat的表达，这表明USP21介导的HIV-1 LTR反式激活抑制是由于Tat表达降低所致。在HEK293T细胞中敲除USP21增加了Tat表达和Tat介导的HIV-1 LTR激活。为了检查USP21对启动子可能的非特异性影响，作者将的USP21与pCMV-luci或pCMV-GFP共表达。结果显示USP21增加了CMV驱动的荧光素酶活性以及绿色荧光蛋白(GFP)表达，表明USP21降低的Tat表达是特异性的。

研究结论：USP21抑制Tat介导的HIV-1 LTR反式激活，但不抑制CMV启动子。

4.USP21通过去泛素化Tat来下调Tat表达

        作者接下来试图通过分析USP21在稳定表达Tat的细胞系中的作用来确定USP21是否影响Tat的mRNA水平。在稳定表达Tat的HEK293T细胞中，USP21降低了Tat的蛋白质水平但未显示mRNA水平的统计学降低，表明USP21引起的Tat下调发生在蛋白质水平。据报道，Tat泛素化对其转录活性至关重要，因此，作者接下来探究了去泛素化对Tat稳定性的影响。作为DUB，作者观察到USP21明显降低了K48-linked和K63-linked泛素化的程度，这对Tat转录活性很重要，表明USP21诱导的Tat去泛素化导致Tat不稳定并抑制Tat驱动的LTR活动。作者接下来使用显性失活泛素突变体(Ub-KO-Flag)，以检测其对Tat稳定性的影响。结果显示Ub-KO明显降低了Tat表达，而USP21显示出比Ub-KO更强的降低Tat表达的能力。为了确认USP21的泛素化酶活性是Tat去泛素化所必需的，作者检测了去泛素化酶缺陷型突变体(C221A)的影响。正如预期的那样，C221A突变体失去了去泛素化K48连接和K63连接的Tat泛素化的能力。这些数据支持Tat泛素化对其稳定性很重要的观点。

研究结论：USP21对HIV-1的抑制与其去泛素化酶活性密切相关。

5.USP21介导的细胞周期蛋白T1表达下调也有助于降低Tat表达

        由于USP21对Tat下调的影响比UB-KO更强，作者推测USP21除了对Tat泛素化的影响外，还有诱导Tat不稳定性的目标或机制。Tat与由CycT1和CDK9组成的正转录延伸因子b(P-TEFb)复合物特异性相互作用，刺激HIV-1转录延伸。先前研究表明CycT1稳定HIV-1Tat表达，作者还探究了USP21对P-TEFb表达以及Tat-P-TEFb相互作用的影响。据报道，在使用抗Myc珠的免疫沉淀(IP)测定中，CycT1与Tat特异性相互作用，并增加了Tat表达。有趣的是，作者观察到USP21还以剂量依赖性方式降低CycT1表达，但在CycT1和CDK9异位表达时增加了CDK9的蛋白质水平。因此，USP21沉默增加了内源性CycT1的蛋白质和mRNA水平，但略微降低了内源性CDK9的蛋白质水平，并且对内源性CDK9的mRNA水平没有影响。此外，即使在USP21存在的情况下，增加CycT1的量也能恢复Tat的表达并促进LTR驱动的荧光素酶活性。因此，USP21敲低增强了Tat介导的LTR激活，而CycT1敲低减弱了Tat介导的LTR激活，而当CycT1被敲低后，由USP21敲低诱导的Tat介导的LTR激活就消失了。

 研究结论：USP21通过降低细胞周期蛋白T1(ycT1)mRNA水平来抑制Tat表达。

6.USP21的去泛素化酶活性是HIV-1抑制和Tat下调所必需的

        为了探究USP21介导的HIV感染抑制是否与其去泛素化酶活性相关，将HIV-1NL4-3感染性克隆与USP21 WT或去泛素化酶缺陷型突变体(C221A)共转染到HEK293T细胞中。USP21 WT的过表达显着降低了上清液中细胞内HIV-1 Gagp55和CAp24的表达以及HIV-1的产生，而USP21 C221A突变体导致HIV-1病毒蛋白的表达和HIV-1产量减少50%。为了进一步验证USP21的去泛素化酶活性是否参与HIV-1抑制，作者比较了USP21 WT和C221A突变体对Tat表达和HIV-1 LTR反式激活的影响。与USP21 WT相比，USP21 C221A突变体在Tat下调和抑制LTR活性方面也存在缺陷。与空载体相比，USP21 WT及其突变体都没有任何显着的细胞毒性，表明USP21的功能不是由于其细胞毒性。作者接下来检查了USP21 C221A突变体是否影响CycT1表达。正如预期的那样，作者发现USP21 C221A突变体也缺乏降低CycT1表达的能力。共定位分析表明，USP21 WT分布在细胞质和细胞核中，并与主要存在于细胞核中的CycT1共定位，而USP21 C221A突变体主要位于细胞质中；因此，它不能与CycT1共定位，导致其有缺陷的CycT1下调。

 研究结论：USP21通过去泛素化Tat和下调Tat稳定性所必需的CycT1表达来影响Tat表达。

7.USP21通过表观遗传修饰CycT1启动子来降低CycT1的表达

        为了探索USP21如何降低CycT1表达，作者首先检查了UPS是否参与USP21对CycT1的下调。作者发现蛋白酶体抑制剂MG132、NEDD8激活酶(NAE)抑制剂MLN4924和自噬溶酶体抑制剂NH4Cl对USP21介导的CycT1下调没有影响，表明USP21对CycT1的下调不涉及泛素化机制。作者接下来通过构建CycT1-Luc表达载体研究了USP21对CycT1启动子的影响。结果显示USP21影响CycT1启动子的活性。基于Genome Browser分析，作者发现CycT1启动子具有表观遗传修饰，包括组蛋白3K4和K9甲基化和组蛋白3K27乙酰化。ChIP测定显示USP21表达明显增加H3K9甲基化，但对H3K4甲基化或H3K27乙酰化没有影响，导致CycT1表达降低。此外，作者发现USP21不影响3-磷酸甘油醛脱氢酶和CDK9启动子上的H3K9甲基化标记，表明对CycT1启动子的影响是特异性的。

研究结论：USP21是HIV-1产生的新型调节剂，并且该调节与USP21去泛素化酶活性有关。

结论与讨论

        在这项研究中，作者筛选了一些USP家族成员对HIV-1感染的影响，发现USP21通过下调Tat表达有效抑制HIV-1的产生。USP21的去泛素化酶活性对于Tat下调至关重要;然而，除了去泛素化Tat泛素化外, USP21还通过表观遗传修饰降低CycT1 mRNA水平，这是Tat稳定所必需的。因此, 作者表明USP21是HIV-1 Tat的新型选择性调节剂。作者的发现为HIV-1药物的开发和治疗提供了一个重要的靶标。

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原文链接：https://doi.org/10.1128/jvi.00460-21