USP22通过抑制未折叠蛋白反应促进HER2驱动的乳腺癌侵袭性

写在前面

        今天推荐的是由德国Göttingen医疗中心在2021年5月18日发表于Oncogene（2020IF：9.867，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Florian Wegwitz教授，研究表明USP22通过抑制未折叠蛋白反应促进HER2驱动的乳腺癌侵袭性。

研究背景

        泛素特异性蛋白酶22(USP22)是哺乳动物SAGA转录共激活复合物的去泛素化亚基。USP22被确定为预测癌症患者治疗失败的所谓“癌症死亡”特征的成员。然而，USP22在不同类型和亚型癌症中的重要性和功能作用仍然未知。

摘要部分

        在本研究中，作者利用人类细胞系和遗传小鼠模型来研究USP22在HER2驱动的乳腺癌（HER2+-BC）中的作用，并首次证明USP22是小鼠和人类HER2+-BC模型中致瘤性所必须的。为了深入了解潜在的机制，作者进行了全转录组的基因表达分析，并确定未折叠蛋白反应（UPR）是USP22缺失后失调的途径。UPR通常在外在或内在的压力下被诱导，如果短期内被激活，可以促进细胞的生存和恢复，如果长期被激活，则可以促进细胞的程序性死亡。作者发现USP22通过稳定内质网（ER）伴侣HSPA5，积极抑制HER2+-BC细胞的UPR诱导。一致的是，USP22的缺失使肿瘤细胞对细胞凋亡更加敏感，并明显增加了靶向ER折叠能力的治疗方法的效率。总之，作者的数据表明，针对USP22活性的治疗策略可以使肿瘤细胞对UPR诱导敏感，并可能提供一种新的、有效的方法来治疗HER2+-BC。

研究内容

1.USP22促进HER2驱动的体内乳腺癌发生

        对TCGA乳腺癌队列中HER2+-BC患者的分析证实，具有高USP22表达的肿瘤患者的预后特别差。为了研究HER2驱动的乳腺癌中Usp22确实的后果，作者使用了转基因小鼠模型，其中编码HER2的基因(Erbb2)在乳腺特异性MMTV启动子(MMTV-Erbb2)下表达。Usp22的乳腺特异性缺失是通过将含有floxedUsp22等位基因(Usp22flox)的小鼠品系与乳腺特异性缺失品系MMTV-Cre杂交实现的。随后对肿瘤发生的监测显示，与Usp22wt/wt动物相比，组织特异性Usp22敲除动物的无病生存期显着增加。值得注意的是，12.5%的Usp22fl/fl小鼠从未患上这种疾病，这表明Usp22在HER2驱动的BC中起着关键作用。进一步的分析表明，Usp22缺失不仅延迟了肿瘤生长，而且还大大降低了肿瘤负荷，这体现在每只动物的肿瘤数量减少和肿瘤生长动力学减慢。作者通过qRTPCR证实了敲除Usp22fl/fl肿瘤的效率。有趣的是，生长肿瘤的形态和H2B单泛素化(H2Bub1)水平都不受Usp22缺失的影响。此外，免疫组织化学分析证实，该肿瘤模型中驱动癌基因HER2的表达不受Usp22缺失的影响。

研究结论：USP22在HER2驱动的BC中具有关键的肿瘤促进作用。

2.USP22缺失损害了HER2+-BC细胞体外的致癌特性

        为了将作者的观察扩展到其他人类疾病，作者使用了两种HER2+人类BC细胞系（HCC1954和SKBR3），并首先研究了USP22确实对其致癌特性的影响。USP22的缺失导致两种细胞系的细胞数量、克隆生长和迁移特性显着减少。为了评估USP22的缺失是否影响HER2信号级联反应，作者探究了USP22缺失后HER2的两个主要下游分子靶标ERK1/2和AKT的磷酸化。与导致pERK1/2和pAKT显着降低的HER2抑制剂拉帕替尼治疗相比，作者没有观察到HCC1954中USP22缺失后HER2下游信号转导的显着变化。与观察到的增殖效应一致，与对照转染细胞相比，HCC1954细胞中USP22沉默后PCNA表达降低。

研究结论：USP22的缺失会在体外和体内干扰HER2+-BC细胞的致瘤性，而不影响HER2表达或其典型的下游信号级联反应。

3.USP22缺失触发HER2+-BC细胞凋亡

        作者通过全转录组分析，在小鼠肿瘤中鉴定出Usp22缺失后的1141个差异调节基因，以及HCC1954细胞中USP22敲低后的496个差异调节基因。随后，作者通过使用基因集富集分析(GSEA)并将体外和体内结果相交，研究了USP22缺陷条件下的常见调控途径。作者观察到，在HCC1954和HER2驱动的小鼠肿瘤中USP22受损时，大多数显着富集的基因集基本上重叠。有趣的是，缺乏USP22的HER2+-BC肿瘤细胞显示出与应激诱导的信号通路和细胞凋亡相关的基因特征的富集。为了评估USP22缺失是否确实诱导HER2+-BC细胞凋亡，作者首先检查了USP22敲低后的细胞形态，并观察到程序性细胞死亡的特征。通过评估裂解的PARP的水平以及通过基于流式细胞术的annexin V测定进一步证实了细胞凋亡的诱导。一致地，通过RT-qPCR和IHC染色测量的Usp22fl/fl乳腺癌中凋亡诱导剂Caspase3及其活性裂解形式的水平升高。符合预期的是，用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD处理几乎完全恢复了USP22缺陷型HCC1954细胞的细胞活力。

研究结论：USP22缺失会在体内和体外触发HER2+-BC细胞的凋亡诱导。

4.USP22缺失增加了HER2+-BC对未折叠蛋白反应的敏感性     

        为了阐明USP22缺陷型HER2+-BC细胞凋亡增加的分子机制，作者重点研究了通常在体外和体内上调的“HALLMARK_APOPTOSIS”特征基因。促凋亡激活转录因子3(ATF3)基因特别引起了作者的注意。在HER2驱动的鼠肿瘤和HCC1954细胞中，通过qRT-PCR验证了ATF3和另一种促凋亡因子BCL10的mRNA水平增加。因此，IHC染色显示Usp22fl/fl肿瘤中ATF3的水平与其野生型对应物相比显着增加。值得注意的是，在siUSP22和Usp22fl/fl肿瘤细胞中都观察到了在其启动子中包含至少一个ATF3结合位点的上调基因的显着富集。     

        ATF3经常在各种细胞应激条件下激活，包括缺氧和内质网(ER)应激。作者假设USP22减少后ATF3表达水平的增加是由于持续的内质网应激所致。为了测试更高水平的ATF3和在HER2+-BC中丢失USP22时受损的肿瘤表型是否是由UPR的持续激活引起的，作者分析了受该途径调节的几种已知标志物和基因。有趣的是，在siUSP22处理的HCC1954细胞中，磷酸化eIF2a（peIF2a）和ATF4的水平升高。在体内，与野生型肿瘤相比，Usp22fl/fl肿瘤中的ATF4蛋白水平也显着增加。一致地，人类HER2+-BC全转录组数据集（TCGABRCA数据集）的GSEA表明，与USP22high肿瘤相比，USP22low病变也具有升高的UPR信号。因此，在HER2+-BC患者中观察到USP22表达与几种UPR反应基因之间存在显着负相关。总之，作者的结果支持USP22在控制UPR信号中的负调控作用。

        如上所述，PERK在UPR的激活中起着核心作用。基于作者的发现，在USP22缺失后p-eIF2A和ATF4水平均增加，同时体内和体外模型中PERK介导的UPR基因表达特征的富集，作者假设USP22可能会抑制PERK激活以维持癌细胞中的低UPR水平。为了验证这一假设，作者在HCC1954和SKBR3细胞中敲低了USP22，并检查了用PERK抑制剂(PERKi)GSK2606414治疗的效果。有趣的是，PERK的抑制不仅逆转了UPR反应基因的激活，而且还有效地挽救了UPS22耗竭引起的与细胞凋亡相关的PARP裂解和两个细胞系的细胞生存能力。

研究结论：USP22促进致瘤表型并通过维持低UPR信号降低HER2+-BC细胞的凋亡率。

5.USP22通过稳定HSPA5抑制UPR诱导的HER2+-BC细胞凋亡     

        USP22已被证明可以去泛素化其他几种细胞蛋白。值得注意的是，最近的泛素组范围分析将热休克蛋白5（HSPA5）确定为前列腺癌细胞中USP22介导的去泛素化的靶点。鉴于HSPA5是PERK活性的主要调节因子，作者假设USP22可能通过去泛素化和稳定HSPA5来抑制UPR激活。作者发现，USP22沉默特异影响HSPA5蛋白水平，而不影响两种人HER2+-BC细胞系中的HSPA5 mRNA表达。类似地，尽管与野生型肿瘤相比，Usp22fl/fl肿瘤表现出Hspa5基因表达的显着增加，但免疫组织化学染色显示HSPA5蛋白水平显着降低。通过USP22介导的去泛素化直接稳定HSPA5表明这两个因素可能共定位于ER。由于尚未报告USP22其在ER室中的存在，因此，作者对USP22进行了免疫染色，并通过共聚焦显微镜检查了它在ER的定位，并且通过用ER特异性染色标记来确认其在ER中的存在。USP22免疫染色的特异性通过siRNA介导的沉默进行了验证。

        作者还发现USP22与HSPA5发生免疫共沉淀，说明两者在细胞中发生物理相互作用。重要的是，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理HCC1954细胞在USP22敲低后恢复了HSPA5水平，进一步证实了USP22通过防止泛素-蛋白酶体系统降解HSPA5在稳定HSPA5中的核心作用。一致地，放线菌酮追踪分析表明，与对照转染细胞相比，USP22丢失后HSPA5的稳定性显着缩短。总之，这些结果证明了USP22在稳定HER2+-BC中的HSPA5方面的作用。与HSPA5low患者相比，具有HSPA5高表达病变的HER2+-BC患者的生存结果较差。因此，作者测试了HSPA5活性的损害是否可以表型复制USP22的缺失并诱导UPR。事实上，通过诱导HCC1954和SKBR3细胞中的ATF3、PPP1R15A、DDIT3、BCL10和CREB5基因表达来衡量，使用特异性抑制剂HA15抑制HSPA5导致UPR信号的显着激活。此外，HA15处理还增加了HCC1954细胞的凋亡率。一致地，HSPA5抑制或缺失显着降低了HER2+-BC细胞活力，并且这些效应可以通过USP22敲低来加强。作者的研究揭示了USP22通过稳定HSPA5来抑制UPR信号激活方面的未知作用。作者的结果进一步表明表达低水平USP22的HER2+-BC细胞对UPR诱导的脆弱性。

研究结论：USP22维持HSPA5的稳定性并抑制HER2+-BC的UPR诱导的细胞凋亡。

结论与讨论

        总之，作者的工作确定了USP22在抑制UPR信号方面的致癌功能，揭示了它在支持细胞蛋白伴侣系统和保护肿瘤细胞免受蛋白态失衡影响方面的全球性作用。因此，可以假设，抑制USP22的活性可以代表一种针对HER2+-BC的创新方法，同时对UPR信号的药理刺激可以增强这些效果。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41388-021-01814-5