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你知道如何设置RNAi的对照？

2022-06-09 17:05 作者:分子科普小feng子 0人读过 | 我要投稿

设计一个完整的RNAi实验涉及许多重要参数，包括基因靶标的类型和数量、细胞系的选择和siRNA传递的方法、下游检测、适当的对照、分析的时间点，以及数据分析的统计方法。

那么你知道如何设置RNAi的对照嘛？

① 阳性和转染对照siRNA

一个已知阳性对照siRNA可以提供其靶mRNA的敲低。使用阳性对照目的是确定转染和沉默的实验设置是最佳的。siRNA常用的阳性对照MAPK1、Lamin A/C、Beta-Actin、 P53、 GAPDH等。

另外，可诱导检测表型的siRNA，如AllStars Cell Death Control siRNAs，也可以用于这一目的。它是一种高效 siRNA 的混合物，靶向普遍表达的人类基因，这些基因对细胞存活至关重要。这些基因的敲除会诱导高度的细胞死亡，这在光学显微镜下是可见的。在转染 AllStars Cell Death Control siRNA 后 48-96 小时，通过简单的光学显微镜观察细胞，即可快速估计转染效率，无需任何复杂或费力的下游检测。

图注1：使用不同量的 AllStars Cell Death Control siRNAs和 50 nM Negative Control siRNA) 转染 96 孔板中的 MCF-7 细胞 (5 x 103)。 72小时后，通过光学显微镜观察细胞死亡。最佳条件是 5 nM siRNA 和 1.5/2 μl HiPerFect Reagent 或 2 nM siRNA 和 2 μl HiPerFect Reagent。

② 阴性对照

阴性对照siRNA通常是一种与任何已知的哺乳动物基因没有同源性的siRNA。转染阴性对照siRNA建立了一个效应基线，用于确定表型或基因表达的变化是非特异性的。在每次实验中都应转染一个阴性对照siRNA。QIAGEN提供各类经实验验证的阴性对照。

图注2：用 AllStars Neg. Control siRNA、另一种阴性对照 siRNA（对照 1）和 CDC2 siRNA（positive）转染 HCT 116 细胞。 CDC2 的敲低会影响细胞周期并导致细胞核增大。72小时后，活细胞核用Hoechst 33342染色，并使用cell^R Imaging System测量单个细胞核的表面积。在该图中 AllStars Negative Control siRNA 产生与未转染细胞相似的核大小分布。

QIAGEN 还提供带有荧光标记的negtive siRNA，同时监测转染效率。AllStars Neg. siRNA AF 488 、AllStars Neg. siRNA AF 647 。

③ Mock对照

Mock对照即模拟转染对，细胞在不添加siRNA的情况下进行转染过程（即，细胞只用转染试剂处理）。该对照用于确定由转染试剂或过程可能引起的任何非特异性效应。

④ 空白对照

使用未处理的细胞作为对照，以测量正常的、基础的基因表达水平。来自未处理细胞的结果可以用来与来自所有其他样本的结果进行比较。未经处理的细胞应该在每个实验中进行分析。

⑤ 使用多个sirna进行表型确认

RNAi研究来说，off-target效应是一个十分关注的问题，有大量证据证明一个siRNA可能影响多个基因的表达，所以由基因敲低引起的表型效应必须使用至少一个针对mRNA的siRNA不同区域的siRNA来确认。一般每个基因使用两到四条有效的siRNA序列。其表型效应应趋向于一致性，并且呈现相应剂量效应。QIAGEN针对次效应设计FlexiTube GeneSolution，其中包含4条siRNA的预混液，高效防脱靶。

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