色谱柱常见问题汇总（四）

一.想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗？

       答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直接接到废液瓶就可以。

二.如果不使用不锈钢接头，而改用PEEK头，是否可以完全解决接头匹配问题？

       答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。

三.有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径（2-5um）的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。那么，你们在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗？

       答：如果前后筛板孔径不对称，厂商肯定也会在说明书里特别提到的。

四.我在做多肽药物时遇到下列问题：1）. 基线不稳定波动大，流动相 A ：1％TFA水溶液 B:1％TFA乙腈溶液检测波长210nm 流速1.0ml/ml 什么原因？怎么解决？TFA有什么作用？流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。2）做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好；3）药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果有什么区别？

       答：应该是起“离子对”的作用吧。在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

       三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

五.waters AtlantisC18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗？在什麽体系中保存比教合适？

       答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：

       流动相中不含缓冲盐：分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min

       流动相中含有缓冲盐：分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用时间不可超过3天）；

       水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。

总结

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