技术分享 | 基因干扰研究工具（下）

背景介绍

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。

由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地沉默基因，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低。

上篇为大家介绍了siRNA、shRNA两种常用的基因干扰工具，详情可点击基因干扰研究工具（上）查看，今天就继续为大家介绍基因干扰相关的特色服务，一起往下看吧~

组织特异性干扰: miR30-shRNA

表达shRNA常用的polⅢ型启动子有U6和H1，由于构建序列较短，shRNA能够轻易的插入病毒载体，但是想实现特定组织中的基因沉默，少不了组织特异性启动子的助力，然而U6和H1并不具有组织特异性。

基于miRNA骨架的shRNA干扰载体，采用了pol II型启动子(包括多种组织特异性启动子)驱动，从而实现特定组织中的基因沉默。目前用于干扰作用的miRNA骨架(如miR30、miR155、miR17-92等)中，最常用的就是miR30结构。

载体优势

01 启动子选择性多

基于mir30的shRNA可以通过RNA聚合酶II启动子转录，包括CMV、CAG、诱导型启动子和组织特异性启动子等，尤其是组织特异性启动子，在这类启动子的作用下，利用miR30结构实现的基因敲低往往只限于某些特定的组织或器官，同时表现出发育调节等特性。

02 多个shRNA共表达

RNA聚合酶II能够有效转录长RNA，因此可以通过多顺反子结构将多个shRNA构建至同一个启动子下，缩减载体长度的同时可以实现对多个基因的RNA干扰。

03 报告基因共表达

通过多顺反子结构将shRNA与报告基因在同一启动子下表达，能更精确地监测shRNA的转录水平。

04 作用稳定且高效

基于miR30结构的shRNA不太容易通过干扰内源性miRNA途径引起细胞毒性；miR30的天然环状结构能确保精确的Dicer切割并减少脱靶效应。

吉满生物可以为客户提供多种特异性启动子，能够实现不同组织/细胞的特异性表达。可以将选定启动子和shRNA序列构建至mir30-shRNA载体上，并能提供序列筛选服务，助力筛选出干扰效果更好的shRNA(mir-30)，此外，我们还可进行后续慢病毒、腺相关病毒的包装，实现组织特异性基因沉默！

Tet-On诱导性干扰

Tet调控表达系统通过诱导药物(如四环素和强力霉素等)改变调控蛋白的构象，从而达到调控目标蛋白表达的目的。TetR(Tet阻遏蛋白,Tet repressor protein)与TetO(Tet操纵子,Tet operator)，能够特异性结合。

当无诱导药物存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游耐药基因的表达；当有诱导药物存在时，TetR的构象会发生改变，并从TetO上脱离下来，使下游耐药基因得以表达。

Tet-on系统组成

Tet-on原理

rtTA是由tTA突变4个氨基酸形成，它的表型与tTA相反。生理条件下，rtTA与TRE不结合，由于PminCMV缺少增强子，因此目的基因不表达；

给于DOX后，DOX与rtTA的结合体与TRE结合，从而启动基因表达。

吉满生物为客户提供tet-on干扰慢病毒包装以及细胞株构建服务。

CRISPRi（基因抑制/沉默）

CRISPRi(CRISPR Interference)系统是在CRISPR/Cas9 的基础上发展而来的，可特异性地抑制靶基因的转录而并非将基因knockout来实现调控。相比于knockout，CRISPRi 能够在不同水平对靶基因进行剂量控制的敲减，是用于抑制内源性基因转录的强大工具。

当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB，可以进一步提高转录抑制的效率。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达，因此适用于多种类型的基因，包括：mRNA、非编码RNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本等基因的转录抑制等。

技术优势

不改变内源基因组背景、介导的敲低是可诱导且可逆、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。

服务流程

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