超详细lncRNA的提取方法——总RNA的提取
lncRNA属于RNA中的一种，要提取lncRNA，则需先将细胞内的总RNA提取出，再利用RT-qPCR对所想要了解的lncRNA进行针对性的定量分析。
与提取细胞内DNA不同的是，由于RNA极易被RNA酶（Ribonuclease, RNase）降解，所以在提取过程中需要格外注意。导致RNA容易降解的原因主要有三个:其一为RNA本身的结构所决定的，与DNA不同，RNA为单链结构，这决定其具有内在不稳定性；其二为RNase结构稳定、且活性强；其三为RNase作为人体进化而来参与形成防御机制的防御物质，不仅分布于体内，也分布于人体体表以及分泌的唾液、汗液以及泪液等中，以防止外源性的RNA进入细胞内后，翻译出蛋白质，给细胞带来致命性的损伤。
为最大程度地降低RNase对RNA的降解，那么我们在实验中的每一个步骤都应时时刻刻想到RNase，并找出去除RNase和（或）抑制其活性的解决方法，总的来说，包括以下几个方面：
① 温度对酶活性的影响：我们都知道，在未达到最适温度之前的一定范围内，酶的活性是随温度的升高而逐渐增强的，而RNase作为机体的一种重要酶成分，其最适温度必定在体温附近，因而在实验动物体温以下的温度范围内，尽量控制低温，可最大程度抑制酶的活性，从而减少RNase对RNA的降解，控制低温的具体方式包括预冷所有所需的常温保存的试剂、避免手直接接触反应混合液所在管壁（体温具有一定影响）等；
② 源于实验者RNase的防护：正如上述提到的，人体分泌的唾液、汗液等均含有RNase，也就是说，在没有较好的防护措施的条件下，即使是说句话、打个喷嚏或者是手碰到器皿，甚至仅是开盖一段时间（空气中也早已布满了RNase），均有可能将RNase引入反应液中，从而干扰实验结果，因此，在实验过程中，我们必须戴口罩以及手套，当然手最好不要直接触碰实验器材，而最好是养成用干净的镊子钳夹的习惯，并且在不需要加反应试剂等操作时，将EP管闭盖放置；
③ 实验器材：实验所用器材，均必须为干净无RNase或者是使用DEPC水(0.1%
焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理过的超纯水，无各种离子及有机物，并可裂解破坏RNase等）理过的；
④ 物理因素：由于RNA结构的不稳定性，因此，震荡混匀时必须轻柔，以减轻物理剪切力，此外，应尽量避免反复冻融、辐射以及高温（与前者温度对酶活性的影响不同的是，此处是指高温可不借助RNase直接使RNA变性破坏裂解）等；
下面以TRIzol法提取小鼠心脏心肌细胞RNA为例，对此进行详细说明：
① 实验所需的离心管(Eppendorf tube， EP管) 、枪头、镊子、剪刀等提前一天用DEPC水浸泡，并于第二天烘干后使用，异丙醇、氯仿、75%乙醇以及无水乙醇等实验所需常温保存试剂均需提前数小时预冷（以下实验中所提及的室温静置时间、试剂量等均可据所用试剂规格以及不同的实验室条件等进行调整）；
② 无菌手术取小鼠的心脏后，加入DEPC水清洗干净，此时可立即取部分心肌开始RNA的提取实验（注意用无RNase镊子夹入另一无RNase的EP管中），也可先将心肌-80℃下冻存，需要时取用；
③ 用无RNase的枪头，每50-100mg心肌组织中立即1mL TRIzol（冰箱4℃保存，无需预冷）；
④ 室温静置15min;
⑤ 每1ml TRIzol中加入200μl预冷的氯仿，轻柔混匀；
·氯仿的作用
氯仿一方面可使蛋白质变性，使其沉淀（蛋白质变性后，结构松散，疏水键暴露，水溶性变差），其中包括RNase，RNase变性后，也可减少RNA的降解；另一方面氯仿作为有机溶剂，可益于苯酚、油脂等有机物杂质的抽提去除。
⑥ 室温静置10min；
⑦ 4℃、12000转/分（revolutions per minute, rpm）离心15min；
⑧ 取上清至新的EP管（吸取上清时须小心，避免吸到含有RNA的上清水相层以及下层紫红色有机层之间薄薄的白色DNA沉淀层，甚至是有机层，最终使Nanodrop 测定RNA纯度时，0D260/OD280的比值偏低，吸取到DNA沉淀使该值轻微下降，吸取到有机物时该值大幅下降。在多组进行对照实验时，可不必将上清吸取得足够干净，而是每个样本均吸取等量的上清，例如每个样本均吸取400mL的上清，也可达到控制变量以及对照的目的，这样可减少吸取到RNA以外杂质的目的），加入等体积预冷异丙醇混匀；
·DNA也是溶于水的，为什么DNA不会和RNA一起进入水相呢？
RNA的溶解度随盐浓度的变化不大，而DNA的溶解度随盐浓度的变化较大，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，而TRIzol中恰含有0.14mol/L的NaCl，且DNA也不溶于有机溶剂中，最终使DNA从水相和有机相中同时析出、在中间形成一层薄薄的白色DNA沉淀层，而RNA仍保留于水相中。
⑨ 室温静置10min；
⑩ 4℃、12000rpm离心15min；
⑪ 弃上清(上清一定要尽量去除干净，减少异丙醇等有机杂质的残留，后续“弃上清”步骤同，其中75%乙醇还可同时去除NaCl等无机杂质。这主要是因为高浓度乙醇是易挥发的，但其它杂质难挥发，若不倾倒干净，则很可能残留于RNA沉淀中，导致Nanodrop 测定RNA纯度时，0D260/OD230的比值偏低，但切不可用力过度，导致RNA沉淀甩出，前功尽弃)，加1ml预冷75%乙醇，轻柔上下颠倒使沉淀悬浮；
⑫ 4℃、12000rpm离心5min；
⑬ 弃上清，加1ml预冷无水乙醇，轻柔上下颠倒使沉淀悬浮；
⑭ 4℃、12000rpm离心5min；
⑮ 弃上清，在室温下，开盖倒扣于干净纸巾上晾干至半透明状，加入适量DEPC水溶解；
⑯ -80℃下长期保存（数年）；逆转录为cDNA后可于-20℃下暂时保存（数月），也可-80℃下长期保存（数年）。保存时间依提取纯度不同而不同，较纯净、含RNase少的RNA密封下即使在室温下也可保存一周左右，4℃保存一个月左右，但切忌反复冻融、开盖，以免使RNA变性、污染。
提取出总RNA后，后续再根据需要，设计对应引物，利用RT-qPCR方法扩增出所需研究的lncRNA即可。
