一文读懂细胞转染（一）

细胞转染是将外源性基团（如DNA, RNA等）导入真核细胞的一种实验技术。随着基因与蛋白功能研究的不断发展，转染目前已成为实验室工作中研究和控制细胞基因工程经常涉及的常规方法。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

细胞转染分为两大类：瞬时转染和稳定转染（永久转染）

瞬时转染（transienttransfection）：指外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，外源片段的表达时间短暂，通常只持续几天，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，多用于启动子和其他调控元件的分析。

稳定转染（Stable transfection）：其实是相对于瞬时转染，指外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可作为游离体存在，且随细胞分裂稳定传递下去。通常需要通过一些选择性标记来筛选以得到稳定转染的细胞系。相对于瞬时转染，稳定转染只是对瞬时转染的细胞进行筛选，以得到稳定整合的细胞株。

传染途径的分析方法

转染途径可以分为三类：物理介导、化学介导和生物介导

1. 物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。

1）电转：

优点：1.原理简单。2.条件优化后可产生重复性的结果。3.不需要载体。4.不限制细胞类型和条件。5.条件优化后可以快速转染大量细胞。

缺点：1.需要特殊的设备。2.需要优化电转脉冲和电压参数。3.对细胞伤害很大。4.细胞死亡率很高因此需要大量细胞会不可逆转地损坏细胞膜，溶解细胞。

2）生物传递粒子传递（粒子轰击）：

优点：1.不限制细胞类型和条件。2.可用于动物体内转染。3.方法直接，结果可靠。4.不限制导入基因的大小和数量。5.主要用于基因疫苗和农业应用。

缺点：1.需要昂贵的设备。2.会对样品产生物理损伤。3.细胞死亡率很高因此需要大量细胞。4.需要准备微粒。5.转染效率相对较低。6.对于研究应用成本较昂贵。

3）显微注射：

优点：1.不限制细胞类型和条件。2.可以单细胞转染。3.方法直接，结果可靠。4.不限制导入基因的大小和数量5.不需要载体。

缺点：1.需要昂贵的设备。2.有技术要求，且是劳动密集型（一次只能转染一个细胞）。3.常引起细胞死亡。

4）激光介导的转染（光转染）：

优点：1.可用于转染DNA，RNA，蛋白质，离子，葡聚糖，小分子和半导体纳米晶体。2.可用于非常小的细胞。3.允许单细胞转染或同时转染大量细胞。4.不需要载体。5.转染效率高。6.适用于多种细胞系。

缺点：1.需要昂贵的激光显微镜系统。2.需要贴壁细胞。3.有技术要求。

2. 化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。

1）阳离子脂质体：

优点：1.操作快速简单。2.结果可重复。3.转染效率高。4.可转染DNA，RNA和蛋白质。5.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。6.可用于体内转染。

缺点：1.需进行条件优化(一些细胞系对阳离子脂质体较敏感)。2.有些细胞系不容易转染。3.血清的存在干扰复合物的形成，导致低转染效率。4.培养基中血清的缺失会增加细胞毒性。

2)  磷酸钙共沉淀：

优点：1.便宜且容易获得。2.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。3.转染效率高（不限制细胞系）。

缺点：1.需要仔细制备试剂 – CaPO4溶液对pH，温度和缓冲盐浓度的变化敏感。2.可重复性较差。3.有细胞毒性，尤其对原代细胞。4.不能采用RPMI培养基，由于其含高浓度的磷酸盐。5.不适用于动物体内转染。

3）葡聚糖：

优点：1.操作简单。2.结果可重复。3.便宜。

缺点：1.对某些细胞有化学毒性。2.只限于瞬时转染。3.转染效率低，尤其在原代细胞中。

4）其他阳离子聚合物：

优点：1.在血清中稳定，对温度不敏感。2.高转染效率（限制细胞系）。3.结果可重复。

缺点：1.对某些细胞有毒性。2.不能生物降解（树枝状大分子）。3.只限于瞬时转染。

3. 生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

1）病毒转染：

优点：1.高转染效率（对原代细胞有80-90%）。2.适用于较难转染的细胞系。3.可用于体内转染。4.可用于构建稳定表达或瞬时表达的细胞系。

缺点：1.被转染的细胞系必须含有病毒受体。2.基因插入大小受限（病毒载体~10 kb，非病毒载体~100 kb）。3.技术难度高，且构建重组蛋白很费时。4.存在生物安全问题（激活潜在疾病，免疫原性反应，细胞毒性，插入突变，使细胞恶性转化）。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。