免疫沉淀系列实验之抗体你选对了吗？
免疫沉淀（IP）及相关的实验技术Co-IP、ChIP、RIP都会涉及到对抗体的使用，包括免疫沉淀和WB检测这两个步骤。有的同学可能就会想到既然都是针对同一个蛋白的抗体，是不是意味着免疫沉淀和WB的抗体可以通用呢？首先明确的是科研工作中有节俭意识是好事，但是不能因此而盲目做了无用功，反而造成了浪费。那么这两种实验的抗体到底能不能通用呢？IP、Co-IP、ChIP、RIP之间抗体的选择又有什么需要注意呢？本期咱们重点聊聊这些实验的抗体选择问题。
整体来说，我们需要了解目的蛋白的特性、抗体的特点以及免疫沉淀技术的原理等，综合多方面信息来选择合适的抗体。就此，小恒总结了以下几点需要考虑的地方：
（1）蛋白的特性
① 了解目的蛋白的结构和修饰方式，与抗体的免疫原性序列进行比对，查看是否能与目的蛋白结合；如果是一些具有特殊表型的蛋白，更是要比对免疫原性序列，看是否能发生交叉反应。
② 外源性表达的截短型或其他突变型重组蛋白，则需要注意抗体的免疫原区是否在重组蛋白区域内；这种情况通常是探讨蛋白互作位点要关注的，可能会出现截短区正好包括所用抗体的识别表位，重组蛋白就无法被检测到；如果重组蛋白无法找到合适的抗体，可以添加蛋白标签进行融合表达，进而可选择标签抗体做检测，即可解决此问题。
（2）抗体的种属特异性
不同物种中的同一种蛋白之间可能会存在着一些差异，比如氨基酸构成、蛋白结构及大小，因此需要了解抗体说明书上标注的可反应种属有哪些。通常来说，大部分商业化抗体是以人源蛋白为模板设计的，结合不同物种同源性蛋白的情况，可用于其他物种进行交叉反应，最常见的是小鼠和大鼠。
（3）实验方法的特点
不同实验方法对蛋白的处理方式不同，例如Elisa、IP、WB、IHC、ICC或是FACS，提取和处理蛋白样本时是否会变性、空间构象的改变等，因此对于抗体所能识别的抗原表位和效价也有着不一样的要求。
（4）单克隆抗体（单抗）还是多克隆抗体（多抗）
使用单抗还是多抗，也要仔细考虑后决定。目前市面上的抗体一般以多抗为主，单抗和多抗在使用上都各有优缺点。单抗特异性强，背景低，但亲和力相对小，检测灵敏度会相应低些，识别位点单一；而多抗的亲和力较好，灵敏度高，但是特异性较差，容易出现非特异性结合的情况，导致背景偏高。
对于WB和免疫沉淀所用的抗体有什么区别？IP、Co-IP、ChIP、RIP的抗体能通用吗？下面继续看看这两个问题。
（1）WB和免疫沉淀实验的抗体需求差异
免疫沉淀系列实验技术能真实反映活细胞中蛋白的互作关系，也就是说蛋白的天然构象得以保留，做免疫沉淀的抗体就需要是能够识别蛋白表面结构的，若抗体识别表位藏在蛋白三级结构内部则不适用，所以必须使用IP级别的抗体，这种抗体通常是用纯化的天然蛋白或重组蛋白来制作的。WB处理蛋白时会进行加热变性为线性结构，三级结构内部的位点得以呈现，这种通常是使用人工合成的多肽制作抗体，以识别蛋白的线性结构且特异性很强。所以WB和IP的抗体不一定能够通用，需要具体问题具体分析，同时进行实验验证才能下定论，或者是直接参考文献，用别人验证过有效的、大厂的抗体。
（2）IP、Co-IP、ChIP、RIP之间的抗体也有区别？
一般来说，如果某一抗体可用于IP，则说明可能也可以用于Co-IP、RIP；虽然和ChIP也没有太大区别，但是ChIP级别的抗体在纯度和特异性上都要求较高，且DNA与蛋白进行交联，若交联后蛋白的结合部位正好是抗体识别表位，就会导致抗体无法识别，导致实验失败。这种情况则需要更换其他抗体，且最好是经过ChIP实验验证的抗体，以确保实验的成功率。另外也要特别注意，即使是通用抗体，其不同实验的使用浓度可能也是不同的，实验前一定要细读抗体使用说明，让实验更顺利地开展。
（3）实在没有ChIP级别的抗体，怎么办呢？
经ChIP验证过的抗体数量确实非常有限，那么可以考虑从其他角度入手进行尝试：
① 尝试使用IP、IHC或ICC的抗体，这些抗体一般是识别蛋白的天然构象，与ChIP类似；
② 比较不同物种蛋白间的同源性，蛋白同源性超过80%可尝试跨物种使用抗体；
③ 目的蛋白融合蛋白标签，外源性表达重组蛋白，以标签蛋白为靶标做ChIP。
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