ADC由抗体和通过可裂解或不可裂解连接子偶联其上的载荷组成。通常这些载荷对于正常细胞的细胞毒性非常大，使其不能被单独用于化疗，但这种高活性药物偶联至抗体后，可以将其导向至肿瘤细胞并降低其对非靶器官的毒性。ADC中的关键在于选择合适的抗体，在保持药物活性的条件下将药物输送至肿瘤细胞。

ADCs抗体的选择

肿瘤细胞与正常组织细胞相比，其细胞膜表面会高表达或专一性表达某些特异性蛋白分子，用于维持肿瘤细胞快速增殖。根据ADC自身的作用特点，适合ADC研发的理想抗体至少应当具备以下特点：①仅与肿瘤细胞表面抗原结合，与正常组织无交叉反应；②与肿瘤细胞表面抗原具有较高亲和力，抗体的亲和常数KD至少在微摩尔/升(μmol/L)水平；③对抗体所结合的抗原已经有比较深入的研究，尽量明确其肿瘤生物学功能；④尽量使用人源化抗体，减少HAMA反应。除此之外，用于制备ADC的抗体要具备一定特性——抗原-抗体复合物需要能够介导ADC的内化。内化后，ADC需要够被运输至合适的细胞器（典型的细胞器为溶酶体）进行细胞内降解以释放细胞毒性成杀伤靶细胞。

在高效的ADC中，抗体的亲和力与内化速度间无明确的联系，虽然传统的观点认为抗体与抗原的结合越牢固则内化速度越快，从而更适合用于制备ADC。但实际上，高亲和力的抗体的内化速度可能较中低亲和力的更慢，例如曲妥珠单抗具有很高的亲和力，而恩美曲妥珠单抗，其抗体部分即为曲妥珠单抗，该ADC内化速度相对其他ADC中的抗体来说更慢。

ADCs抗体的内化检测

有多种常规方法用于检测内化，包括共聚焦显微镜、放射性标记抗体/ADC检测和流式细胞术等方法。这里简单介绍使用流式细胞术方法评价纯化抗体的内化，该方法不需使用荧光素或放射性物质对待评价抗体进行标记。

①所需试剂

除非特别说明，所有试剂均存放于4℃；

(1)磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.2；

(2)0.25%胰酶-EDTA；

(3)FACS染色缓冲液：含2%灭活胎牛血清FBS)的PBS；

(4)纯化的候选抗体；

(5)荧光素标记的二抗，如Alexa Fluor488标记的羊抗人IgG(H+L)二抗；

(6)离心管；

(7)移液器和枪头；

(8)冰盒；

(9)冷冻超速离心机；

(10)流式细胞仪；

(11)振荡混匀器；

②检测方法

除非特别说明，所有步骤均需在冰浴或4℃条件下进行，检测所需试剂也需冰浴使用。

(1)收获细胞：若细胞为悬浮细胞，将细胞悬液收集于锥形底离心管中；若细胞为贴壁细胞，使用胰酶-EDTA使细胞从培养瓶或培养皿上脱落后，将细胞液置于锥形底离心管中。使用台盼蓝染色测定细胞存活率，并于4℃、300g 离心5 min沉淀细胞，加入FACS染色缓冲洗细胞一次。再次离心细胞并使用合适体积的FACS染色缓冲液重悬细胞，使重悬后细胞浓度为2X107细胞/mL。

(2)制备用于染色的细胞：将细胞液以50 μL/管(1X106细胞/mL)分装至各离心管中。理想情况下，样品需进行两个样品或三个样品的平行检测，以确保检测结果的准确性。

(3)抗体结合细胞：将使用FACS染色缓冲液稀释的一抗和细胞悬液合并至终体积100μL，使合并后液体中一抗浓在合适范围内(1~20μg/mL)，轻柔振荡使混后于冰浴中孵育60min。

(4)洗涤未结合抗体：加入2mL FACS染色缓冲液洗涤细胞，移除未结合抗体。4℃ 300g离心5min沉淀细胞，弃去上清。重复洗涤2次。

(5)37℃ 孵育使结合抗体内化：每个离心管中加入200μL FACS染色缓冲液后，于37℃孵育15min至2h的不同时间，使结合于细胞表面的抗体内化。使用另一个在4℃孵育相同时间的样品管作为无内化的阴性对照。在各时间点，将该时间点对应的37℃孵育试管移至冰浴，并加入2 mL冰浴FACS 染色缓冲液终止内化。同时向4℃孵育的对照试管中加入2mL冰浴的FACS染色缓冲液4℃、300g离心5min沉淀细胞。

(6)使用荧光标记的二抗标记结合于细胞表面的抗体：在各离心管中加入20μL Alexa Fluor488标记的羊抗人IgG(H+L)二抗，4℃避光孵育30min。

(7)洗涤未结合二抗：加入2mL FACS染色缓冲液洗涤细胞，移除未结合抗体。4℃、300g离心5min沉淀细胞，弃去上清。重复洗涤2次、将染色后细胞重于500μL冰浴PBS中。

(8)流式细胞仪检测细胞表面的荧光强度：为获得最好的结果，在细胞洗涤完成后尽快使用流式细胞仪分析。

(9)细胞表面结合抗体的内化水平通过计算37℃孵育样品相对于4℃孵育对照样品的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)降低水平得出。计算各时间点37℃孵育样品和4℃孵育对照样品的平均荧光强度，计算出内化百分比和细胞表面结合抗体百分比(%MFI)。