如何从杂交瘤细胞中测序获得抗体基因？

近年来，各种抗体库技术的发展使得制备针对特定靶标的重组工程抗体的技术已经千差万别。但如何从多种类型的抗体生产细胞，如小鼠的杂交瘤细胞、人的B细胞等抗体生产细胞中克隆正确的目标抗体V区基因或是抗体结合位点的基因片段，仍然是研究者开展基因工程抗体研究所面临的第一个问题。经过多年的发展完善之后，研究者们已经建立了一套很有效的基于PCR的技术路线和方法，来从各类抗体生产细胞中克隆单一或者混合的抗体V区基因。 在Morrison等人发明最早的基因工程抗体——人-鼠嵌合抗体时，他们仅采用了来自基因组序列的小鼠V区基因片段进行重组，构建嵌合抗体基因。随着PCR技术的出现和普及、应用，研究者发现使用小鼠V区基因cDNA基因片段进行重组构建更为便捷有效。对于从生产单一抗体的细胞如小鼠杂交瘤细胞中克隆V区基因cDNA基因片段，目前研究者普遍采用的方法是RT-PCR法，先反转录制备细胞的cDNA，或相应抗体基因的DNA，然后利用经过精心设计的套装引物，采用PCR的方法从中特异扩增目标抗体的轻重链V区基因片段，分离这些PCR扩增片段，常规克隆入相应载体之后，采用测序、测定结合活性等手段鉴定所克隆获得的抗体轻重链V区基因。上述过程通常所有的操作均可以按照标准的分子克隆程序进行。 在采用RT-PCR法克隆抗体轻重链V区基因的过程中最关键的是设计用于PCR特异扩增抗体V区基因的套装引物。虽然对于每一种单克隆抗体来说其V区基因两端的序列都有可能是不同的，但经过多年的研究积累，目前人们对于各种抗体V区基因两端序列的变化规律已经有了深入的认识，同种类型的单克隆抗体V区基因的两侧序列具有很高的同源性。通过使用多个同源性高的两端序列，并结合简并碱基的引物设计方案，研究者已经设计出大量的V区基因PCR扩增套装引物，它们多数在实际应用中都能有效地扩增，获得目标抗体的V区基因cDNA片段。当遇到某套装引物不能奏效时，仍然可以尝试其他套装引物直至获得合适的扩增片段。 在采用RT-PCR法克隆抗体轻重链V区基因时仍然有一些问题是需要我们高度重视并小心处理的。首要需要注意的是，杂交瘤等抗体生产细胞往往是不稳定的，抗体基因的突变和丢失将可能随着体外培养时间的延长而变得越来越严重，导致克隆获得错误的抗体V区基因，甚至根本无法扩增克隆出V区基因。因此，获得稳定分泌抗体的杂交瘤克隆，或在克隆V区基因之前进行适当的亚克隆操作，保证所提取的细胞DNA均含有正有标抗体V区基因，确保最终能克隆获得正确的抗体V区基因。另外，扩增用的简并套装引物虽然为PCR扩增的成功提供了保障，这种引物设计的方式以及包括PCR扩增过程本身，都有可能为抗体V区基因的克隆带来突变的风险，导致克隆的抗体V区与抗原结合的特性发生显著的改变。对多个所获得的抗体V区基因克隆测序可以排除PCR扩增过程本身所带来的突变。这些突变可能多数不起作用，但有时也能显著影响抗体结位点与抗原结合的特性。为了确保测序结果的准确性，可对所获抗体V区是否能正确地与抗原结合进行适当的鉴定。 即便是分泌单一单克隆抗体的杂交瘤细胞中也同时具有多个完整的抗体基因，有时我们还会碰到同时克隆出多个具有正确的抗体V区基因特征的基因片段，这时分别鉴定其表达的抗体的结合功能是我们确定正确的目标抗体V区基因的唯一办法。 德泰生物自建杂交瘤测序平台，基于RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术和Failsafe®假基因排除技术，能够提供快速、可靠的杂交瘤抗体基因测序服务http://www.detaibio.com/hybridoma-antibody-sequencing-service.html。可对抗体的可变区或全长进行准确测序，测序范围涵盖小鼠、大鼠、兔、山羊等物种。同时，德泰生物还拥有成熟的抗体表达平台，可以将获得的抗体基因进行表达、纯化、验证，测序表达快至1周。