植物组培苗的细菌与真菌污染

2023-03-20 10:22 作者:济南腾昊组培室建设 0人读过 | 我要投稿

污染：在组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的浸染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。在组织培养中污染是经常发生的，造成污染的原因也很多，主要有：

1、培养基及各种使用器具消毒不彻底。

2、外植体灭菌时不彻底，有菌残存在细胞中。

3、操作时人为因素带入。

4、环境不清洁。

5、超净工作区域污染。

在组织培养实验室中，污染的病原分为细菌和真菌两大类。

细菌污染的主要特征是：在培养过程中，培养基或外植体上出现黏液状或水迹状物，有时需要仔细辨认才能看清。这种症状表明，所受的污染可能是细菌污染，在接种1～2d即可发现。

细菌污染主要是由于培养基灭菌不够彻底，材料带菌或在接种操作时没有对外植体进行彻底灭菌所致。主要是工作人员使用了未经充分灭菌的工具(镊子、培养皿等)及呼吸时呼出的细菌所引起的。也可能是手接触材料或器皿边缘，使微生物落入材料或器皿，要求操作人员严格按照无菌操作程序操作。

真菌污染的识别方法：接种后培养基或外植体表面出现白、黑、绿等色的块状真菌孢子，其蔓延速度较快，在接种3～10d后可发现。真菌污染比较容易通过空气、培养容器、瓶口进行污染，因此要加强对空气的灭菌管理，在每次操作前，最好先用紫外线灯灭菌20～30min，再用75％的酒精对容器材料表面进行喷雾灭菌。此外，外植体的褐变有时也是造成培养基或被培养物污染的原因之一。

污染的预防措施

要定期对接种环境进行熏蒸消毒，所有器具均需进行高温灭菌后才能使用。要定期对超净工作台的初过滤器进行清洗和更换。在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌20min，操作前用75％酒精擦拭整个操作台面；接种前，工作人员必须彻底地洗手，并用70％酒精棉球擦拭双手。在每次接一两瓶材料后，最好再用酒精擦一下手指，接种用的镊子和解剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌(必须冷却后才能用于接种材料)。材料接种好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶口各部分都烧到，目的是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。建议不要在超净工作台里使用酒精灯等灯具，因为这样热的火焰会引起空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流，使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层，带来更多的污染机会。

在用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中，使其抽枝，然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体，可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自户外的枝条进行暗培养．待抽出较长的新生枝条时再采取枝条，也可明显减少污染。此外，避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采材料时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。

由于植物组织培养材料只能进行表面灭菌，表面消毒并不能除掉所有的病菌，有些病菌可以侵入材料内部，尤其是木本植物，材料内部易感染病菌，因而必须在培养基中加入抗生素类药品来有效控制这类污染。但应注意抗生素对某些种类的植物生长有抑制作用，至于植物该使用哪一类抗生素，用多大浓度才适宜，要在实践中去摸索。如彩色马蹄莲在组织培养时，培养基中添加了不同种类不同浓度的抗生素，发现50mg/L硫酸链霉素抑菌效果最好。芦笋组培苗继代时，采用四种抗生素处理来防治细菌污染，多种抗生素都能抑制细菌的污染，其中以卡那霉素抑制效果最好。

此外．所用的培养基一定要在培养室中预培养2～3d．然后再进行检验，确定无细菌感染的迹象后才能使用。为了防止因接种而造成细菌，应对初代培养、继代培养的繁殖材料进行系统地检查，发现有被细菌污染的迹象时，应该将其清除。

黄精的组培

黄精是百合科、黄精属植物。根状茎圆柱状，由于结节膨大，因此“节间”一头粗、一头细，在粗的一头有短分枝，直径1-2厘米。茎高50-90厘米，或可达1米以上。花序通常具2-4朵花，似成伞形状，总花梗长1-2厘米，花梗长（2.5-）4-10毫米，花被筒中部稍缢缩，裂片长约4毫米；花丝长0.5-1毫米，花药长2-3毫米；子房长约3毫米，花柱长5-7毫米。浆果直径7-10毫米，黑色，具4-7颗种子。花期5-6月，果期8-9月。

黄精主要分布于中国、朝鲜、蒙古和苏联西伯利亚东部地区；在中国分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、陕西、内蒙古、宁夏、甘肃（东部）、河南、山东、安徽（东部）、浙江（西北部）、江西（铜鼓）等地。生长于海拔800-2800米的林下、灌丛或山坡阴处。

根状茎为常用中药“黄精”。黄精食之性味甘甜、爽口，又是很多中药配方的主要材料，秦岭林区具有悠久的采用传统。黄精可用于脾胃虚弱、体倦乏力、口干食少、肺虚燥咳、精血不足、内热消渴等症及治疗肺结核、癣菌病等。黄精根茎含有多种营养成分，包括糖分、脂肪、蛋白质、淀粉、胡萝卜素、维生素等，生食、炖服均可，既可以充饥，又可以健身。

繁殖方式

种子繁殖

8月采收黄精果实，立即搓去果肉，用3%的过氧化氢消毒，将种子与湿沙以1:3的比例混匀，沙藏于透气性好的坡地，待种子萌发，按行距10-15厘米条播于畦上，覆盖麦草或遮阴网保湿保温。幼苗出土即揭去麦草或遮阴网，定期锄草，2年后可移栽至大田。

切块繁殖

黄精无性繁殖周期相对较短，产量形成快，是生产中最常见的繁殖方式。10月底黄精收获时，将2-3年生、带有芽头的黄精根茎先端幼嫩部分2-3节切下作为种栽。注意尽量不要把须根去掉，在须根干枯前移栽（若须根除去或干枯则种栽形成新的根茎前不会发新根，若保持原有的须根完好则须根仍可保持活力，且可生出新根）。上冻前在畦上盖一层厩肥，有利于越冬保暖。

组织培养

用组织培养无性繁殖的苗，经炼苗处理后，按照大田种植标准进行栽培。滇黄精组织培养外植体应在3-4月份选择当年生、生长健壮、无病虫害的植株，以其根茎为繁殖材料。将所选材料的地下块茎用水刷洗干净，去掉叶片和根系，切下根状茎上的芽，切取顶芽2-3厘米，用200毫克/升羧苄西林钠或头孢唑林钠进行浸泡处理5小时，浸泡时进行振荡（26℃，每分钟112转），取出材料后用无菌水清洗2次，接着用75%乙醇漂洗30秒，无菌水清洗一次，1克/升氧化汞灭菌5分钟，再用无菌水清洗3次。晾干后切成0.5立方米左右大小，然后接种子培养基上。

由于种子繁殖的周期相对较长，应用上较多使用根状茎繁殖。黄精通过根状茎繁殖会造成黄精中药材的浪费，而且无性繁殖，根状茎容易携带母体病毒，造成病毒在植株体内代代累积，导致植株感病严重。严重影响其黄精的产量和品质。通过组培快繁技术，不仅能加快黄精的繁殖速度，还能提供无菌、健康、优质的黄精种苗。

外植体的消毒

将从土中挖出的黄精用清水洗净泥土，根状茎去除须根，选择色泽鲜黄生活力较强的根状茎做为外植体。用刀切取带芽根茎在饱和的无酶洗衣粉中泡洗30min（隔几分钟轻轻顺时针搅动），然后流水冲洗1-1.5h，在清水下用软毛刷清洗表面，随后转移至超净工作台内灭菌烧杯中。用75%酒精浸没外植体浸泡消毒30s-1min，然后用无菌水清洗2-3次；再用0.1%的氯化汞溶液浸泡5～15min，用无菌水清洗5次，最后将外植体用镊子夹出用无菌滤纸吸干水分。

不定芽的诱导

将外植体消毒后，接种于MS+1.0～4.0mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+0.7％琼脂+3％蔗糖培养基中，PH5.8。培养室的温度控制在25℃±2℃,光照16h/8h（12h/d）,光照强度约为2000lx。

增殖培养

外植体经诱导培养20d后，发出新芽，30d后新芽长成细嫩的茎段。将无菌带芽块茎切成直径0.5cm大小的丛生芽块，切除块茎底部发黑褐化的部分以及部分叶片和苞衣后转接到增殖培养基上。增殖培养基为MS+1.0～4.0mg/L6-BA+0.1～1.5mg/LNAA（或IAA）+0.7％琼脂+3％蔗糖，PH5.8。