小鼠模型开启免疫基因治疗新思路——为血液罕见病带来希望

血液系统负责氧气和营养的输送、代谢产物的排出、免疫细胞的运输和凝血，和免疫系统共同维持机体的健康和免疫防御。血液系统基因异常可能导致一系列免疫或血液相关的罕见疾病。

除了传统的化疗和造血干细胞移植等治疗方法外，科学家们一直在寻找新的治疗血液罕见病的方法。近年来，小鼠模型为免疫基因治疗带来了新思路，成为了研究血液罕见病的新方向。今天我们就来讲讲几个罕见的血液系统疾病及其相关基因敲除小鼠模型。

维生素B12选择性吸收障碍综合征（IGS1）

维生素B12选择性吸收障碍综合征（IGS1）是一种由于维生素B12水平低引起的疾病。维生素B12参与红细胞形成和大脑及中枢神经系统维护，但人体只能从食物中获取。IGS主要症状为巨幼红细胞性贫血，一半以上患者存在尿蛋白现象。血液系统异常还会导致生长发育迟缓、胃肠道或呼吸道感染等症状，以及肌张力减弱、运动障碍、发育迟缓或混乱等神经系统缺陷，并伴有泌尿道异常[2]。目前治疗主要通过补充维生素B12，可短期内改善贫血症状并缓解神经系统症状，但无法根治。

CUBN基因编码的Cubilin蛋白参与从食物中摄取维生素B12到人体内的过程。Cubilin主要存在于肾细胞和小肠细胞上，通过与Amnionless蛋白附着固定在细胞外膜。Cubilin与通过小肠和肾脏的维生素B12结合形成复合物，再被Amnionless蛋白转移到肠细胞内并释放到血液中运输到全身。CUBN突变导致Cubilin功能障碍，无法与维生素B12形成复合物，影响其吸收[3]。在小鼠中，Cubn基因全身性敲除会导致胚胎期致死，胚胎发育迟缓。虽然突变体胚胎中形成了尿囊和心脏等中胚层结构，但其他中胚层组织发育异常或缺失[4]。

Cubn基因外胚层条件性敲除小鼠可存活且发育大体正常，但肾脏近曲小管细胞对维生素B12吸收存在明显缺陷，导致血浆中维生素B12含量急剧下降并出现部分血液系统异常。此外，该小鼠体内转铁蛋白和白蛋白等巨球蛋白排泄增加，导致蛋白尿产生[5]。

除CUBN外，AMN也是IGS致病基因之一。AMN基因编码的Amnionless蛋白将Cubilin-维生素B12复合物转移到肠细胞内并释放到血液中运输到全身。此外，Amnionless蛋白还与血浆脂蛋白的组装、重塑和清除等过程相关。AMN基因突变导致Cubilin-维生素B12复合物无法附着在小肠和肾脏细胞上，影响其吸收。与Cubn-KO小鼠相似，Amn基因敲除小鼠没有羊膜，胚胎发育受损严重，存在胚胎致死现象且缺乏产生躯干的中胚层[6-7]。

此外，通过胚胎干细胞（ES）技术构建Amn缺失小鼠嵌合体可形成解剖学正常的肾脏和肠道，但小鼠表现出选择性蛋白尿。在Amn缺失小鼠组织中，Cubn未能正确定位到细胞表面，Amn缺失的胚胎和成年小鼠同样表现出对Cubn配体的选择性蛋白尿[8]。

红细胞增多症&贫血

红细胞是人体内含量最多的血细胞，主要功能是携带氧气从肺部运输到身体各组织和器官，以及将二氧化碳从组织运输回肺部呼出。红细胞从造血干细胞生成成熟的过程受多种细胞因子密切调控，其中红细胞生成素（EPO）最为重要。EPO与红细胞生成素受体（EPOR）结合激活受体，刺激多种信号通路，导致红细胞形成和成熟。红细胞生成异常会导致贫血、地中海贫血和红细胞增多症等疾病。EPOR和EPO是两个重要的致病基因，至少16种EPOR基因突变会导致家族性红细胞增多症[9]。大多数EPOR基因突变导致生成异常短的红细胞生成素受体，使其与EPO结合后长时间保持异常激活状态，过度活跃的受体即使不需要红细胞也会发出生产信号，导致血液中红细胞过多。此外，EPOR完全缺失的突变也会导致贫血。

EPO和EPOR除促进红细胞生成外，还发挥促进心脏和中枢神经系统发育、改善学习和记忆等非红细胞生成功能。因此，在小鼠中，Epor全身性敲除小鼠出现其它系统障碍，表现出胚胎发育障碍或异常等表型，并在胚胎第11-12.5天死于子宫内，伴有严重贫血。因此，Epor纯合敲除小鼠不适合红细胞增多症研究，但可用于胚胎发育、原始造血调控和贫血方面研究[10]。

与Epor全身性敲除小鼠相似，Epo全身性敲除小鼠同样胚胎致死，死亡前胚胎中存在严重造血缺陷，表现为胎肝中红系祖细胞数量严重减少[11]。得益于基因编辑技术，可通过Cre/Loxp系统构建Epo条件性敲除小鼠，这类小鼠可存活到成年并在诱导后出现晚发型贫血表型。Cre重组酶活性表达后，Epo杂合敲除小鼠（EPO KO/flox）在3周内发展成中度至重度贫血[12]。

血小板无力症（GT）

血小板无力症（GT）是一种先天性凝血异常疾病，患者受伤时血液无法正常凝结，造成血流不止。这种常染色隐性遗传病临床上常见自发性粘膜出血，重者可内脏出血。治疗主要依靠预防、保护、止血、血小板输注，重症患者需造血干细胞移植治疗。GT由血小板膜糖蛋白GPⅡb（CD41/Itgb2b）和/或GPⅢa（CD61/Itgb3）数量或质量异常导致，造成血小板对各种生理性诱导剂聚集大大减低或缺失。GPⅡb和GPⅢa基因分别编码血小板上的糖蛋白Ⅱb和Ⅲa，两种糖蛋白结合形成GPⅡb/Ⅲa复合物，也称整合素αⅡbβ31。该复合体是纤维蛋白原和von Willebrand因子的受体，有助于血小板激活[13]。

Itgb3（CD61）编码的β3整合素在血小板聚集和血栓形成以及着床、胎盘形成、血管生成、骨重塑和肿瘤进展等功能中起重要作用。Itgb3基因敲除小鼠可存活和生育，表现出GT所有主要特征，包括血小板聚集和凝块收缩缺陷、出血时间延长、皮肤和胃肠道出血，还有概率出现胎盘缺陷导致胎儿死亡、产后出血导致贫血和存活率降低等情况[14]。同时也存在血小板计数减少、脾脏增大和髓外造血等非GT患者表型[15]。

Itga2b（CD41）基因编码的整合素αIIb是经典血小板标志物，与整合素β3形成异二聚体，与纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白和血管性血友病因子结合，发挥与Itgb3相似作用。但值得注意的是，Itga2b也是胚胎干细胞体外分化过程中第一个血液特异性标志物，在早期胚胎所有造血干细胞和祖细胞上表达。因此，Itga2b基因敲除小鼠除表现GT样表型外，还表现出多系造血缺陷和造血干细胞静止性和存活率降低等表型[16]。

赛业生物罕见病研究资源

基因编辑小鼠模型在罕见病机制研究和药物研发评价中起着重要作用，赛业生物拥有数千种自主研发的基因编辑小鼠品系，可提供包括CUBN、AMN、EPO和EPOR等在内的多种基因敲除或条件性敲除罕见病研究小鼠模型。同时也可根据您的科研需求进行专业化的定制服务，加速您的课题研究。

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赛业生物启动了HUGO（Humanized Genomic Ortholog）计划，诚邀全球合作伙伴共同开发新型全人源化模型助力新药研发。

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HUGO-GTTM基于自主研发的TurboKnockout-Pro技术，对鼠源基因实现原位替换，成功构建了涵盖更丰富干预靶点的全基因组人源化小鼠，实现致病基因突变位点的全覆盖，其中的全人源化靶基因有效提升药物筛选效率，可广泛用于不同类型药物临床前实验。

参考文献：

[1]MRG Science. “Topic 6.3 Defense Against Infectious Disease.” MRG Science, www.mrgscience.com/topic-63-defense-against-infectious-disease.html. Accessed 20 July 2023.

[2]Scheibel E, Heilmann C, Hjelt K, Nielsen S. Imerslund-Gräsbeck's syndrom. Selektiv intestinal vitamin B12 malabsorption og proteinuri [Imerslund-Gräsbeck's syndrome. Selective vitamin B12 malabsorption and proteinuria]. Ugeskr Laeger. 1981 Oct 19;143(43):2818-9. Danish.

[3]Guéant JL, Guéant-Rodriguez RM, Alpers DH. Vitamin B12 absorption and malabsorption. Vitam Horm. 2022;119:241-274.

[4]Smith BT, Mussell JC, Fleming PA, Barth JL, Spyropoulos DD, Cooley MA, Drake CJ, Argraves WS. Targeted disruption of cubilin reveals essential developmental roles in the structure and function of endoderm and in somite formation. BMC Dev Biol. 2006 Jun 20;6:30. 

[5]Amsellem S, Gburek J, Hamard G, Nielsen R, Willnow TE, Devuyst O, Nexo E, Verroust PJ, Christensen EI, Kozyraki R. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. J Am Soc Nephrol. 2010 Nov;21(11):1859-67.

[6]Tanner SM, Aminoff M, Wright FA, Liyanarachchi S, Kuronen M, Saarinen A, Massika O, Mandel H, Broch H, de la Chapelle A. Amnionless, essential for mouse gastrulation, is mutated in recessive hereditary megaloblastic anemia. Nat Genet. 2003 Mar;33(3):426-9.

[7]Kalantry S, Manning S, Haub O, Tomihara-Newberger C, Lee HG, Fangman J, Disteche CM, Manova K, Lacy E. The amnionless gene, essential for mouse gastrulation, encodes a visceral-endoderm-specific protein with an extracellular cysteine-rich domain. Nat Genet. 2001 Apr;27(4):412-6.

[8]Strope S, Rivi R, Metzger T, Manova K, Lacy E. Mouse amnionless, which is required for primitive streak assembly, mediates cell-surface localization and endocytic function of cubilin on visceral endoderm and kidney proximal tubules. Development. 2004 Oct;131(19):4787-95. 

[9]McMullin MF. Diagnostic workflow for hereditary erythrocytosis and thrombocytosis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2019 Dec 6;2019(1):391-396.

[10] Kieran MW, Perkins AC, Orkin SH, Zon LI. Thrombopoietin rescues in vitro erythroid colony formation from mouse embryos lacking the erythropoietin receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Aug 20;93(17):9126-31. 

[11] Wu H, Liu X, Jaenisch R, Lodish HF. Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell. 1995 Oct 6;83(1):59-67. 

[12] Zeigler BM, Vajdos J, Qin W, Loverro L, Niss K. A mouse model for an erythropoietin-deficiency anemia. Dis Model Mech. 2010 Nov-Dec;3(11-12):763-72.

[13] Coller BS. αIIbβ3: structure and function. J Thromb Haemost. 2015 Jun;13 Suppl 1(Suppl 1):S17-25. 

[14] Hodivala-Dilke KM, McHugh KP, Tsakiris DA, Rayburn H, Crowley D, Ullman-Culleré M, Ross FP, Coller BS, Teitelbaum S, Hynes RO. Beta3-integrin-deficient mice are a model for Glanzmann thrombasthenia showing placental defects and reduced survival. J Clin Invest. 1999 Jan;103(2):229-38. 

[15] Li D, Peng J, Li T, Liu Y, Chen M, Shi X. Itgb3-integrin-deficient mice may not be a sufficient model for patients with Glanzmann thrombasthenia. Mol Med Rep. 2021 Jun;23(6):449. 

[16] Gekas C, Graf T. CD41 expression marks myeloid-biased adult hematopoietic stem cells and increases with age. Blood. 2013 May 30;121(22):4463-72.