众所周知，HE染色是组织切片最常用的染色法之一。其中，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸表现为蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分呈现红色。

但如何保证自己每一次都能完成漂亮的染色呢？有道是老马都可以失前蹄儿，为了让大家对HE染色有着更清晰的认识，我特地搜集查询了下面的内容，希望能对大家的染色技巧有一定的提升。

一、实验原理

细胞浆染色的原理

伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点（4.7—5.0）以下时，胞浆蛋白质以碱式电离，则细胞浆带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。

细胞核染色的原理

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

分化作用

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

返蓝作用

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水出去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。

二、染色步骤详解

烤片

1小时，温度60℃-65℃（目的：使组织切片与载玻片贴合的更加紧密）；

具体染色步骤

三、HE染色实操注意事项

1.组织固定

组织样本必须被充分固定，以防止处理过程中组织细胞的破坏。用10％缓冲福尔马林（Formalin）进行固定通常是一个比较好的选择。

2.切片制备

对于组织样本的切片厚度和形状需谨慎考虑。切片应该是均匀的，并且不能太薄或太厚。一般来说，4-5微米是一个常见的厚度。

3.pH值调节

染色时调节pH值很重要。组织切片在染色前必须在适当的缓冲液中浸泡，在染色期间pH值应始终稳定.如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

4.控制分色时间

切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

5.彻底脱去酒精

组织切片需要通过一系列的酒精浓度逐渐脱水，并用透明剂如苯酚、二甲苯等进行透明化。透明化后切片会变得更加清晰，便于染色。

切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

6.保持切片的湿润

在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

7.保持切片的湿润

切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

8.封片注意事项

最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

9.洗涤

洗涤步骤很重要。未充分清洗会导致染色剂残留，影响结果的质量。每个处理步骤后，应该用足够的缓冲盐水彻底洗涤。

10.避免空气暴露

空气中的灰尘和污染物会对实验产生不利影响，因此在染色过程中，需要避免将切片长时间暴露在空气中，并保持实验室的清洁和卫生。

11.监控染色反应

染色的过程应该密切监测，以便在必要时进行微调。需要管理好每个步骤的时间和温度，以避免过度染色或染色不足的情况发生。

四、常见问题及解决方法

1.细胞核染色浅

原因：苏木精染色时间太短；苏木精染液过度氧化；分色时间过长；如果骨组织细胞核染色浅则是脱钙过度造成的。另外如组织在酸性固定液如Zenker、Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核着色能力也会变差。

解决方法：增加染色时间；或者提高组织的嗜碱性，如使用Weigert铁苏木精染色液。如组织是用Zenker液固定的，可将切片脱蜡后放在5%碳酸氢钠溶液3~4小时，流水冲洗5min后再进苏木素染液染色。如组织是用Bouin液固定的，可将切片脱蜡后放在5%碳酸锂溶液1小时，流水冲洗10min后再进苏木素染液染色。

2.切片在脱蜡后出现白色斑点

原因：烤片温度太低，切片脱蜡时没有充分烤干，脱蜡不彻底

解决方法：先用无水乙醇去除切片上的水分，然后重新用二甲苯脱蜡；脱蜡时间相应延长，或更换新的二甲苯（二甲苯用的时间长的话脱蜡效果会下降）。

3.细胞核染色太深

原因：苏木精染色时间太长；分色时间过短。

解决方法：调整染色和分色时间。

4.细胞核呈棕色

原因：苏木精染液过度氧化；染色后返兰不足。

解决方法：及时更换染液；增加返兰时间，必要时使用0.5%~1%的氨水返蓝。

5.细胞质过染、分色不足

原因：伊红染液浓度过高或染色时间过长；75%乙醇和85%乙醇中时间过短。

解决方法：降低伊红染液浓度或缩短染色时间，增加在75%乙醇、85%乙醇中的停留时间。

6.切片中出现蓝黑色沉淀物

原因：氧化汞作为氧化剂的苏木精染液会在染液表面形成氧化膜。

解决方法：用时用滤纸去除。

7.伊红染色浅

原因：伊红染液PH值过高；75%乙醇和85%乙醇中时间过长。

解决方法：用冰醋酸调整伊红PH值为4.6~5.0；缩短在75%乙醇、85%乙醇中的停留时间。

8.封片后有气泡

原因：封片时操作不当。

解决方法：用镊子轻轻压盖玻片，赶出气泡，如气泡太多，赶不出且影响观察时，把切片放入二甲苯中，去除中性树胶，待盖玻片从载玻片上自然脱落，重新封片。

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