去泛素化酶USP15调节同源重组修复和癌细胞对PARP抑制剂的反应
写在前面
今天推荐的是由国家蛋白质中心在2019年5月15日发表于Nature Communications（2020IF：14.919，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Huadong Pei教授，研究表明去泛素化酶USP15调节同源重组修复和癌细胞对PARP抑制剂的反应。
研究背景
聚合酶抑制剂 (PARPi) 选择性地杀死具有BRCA1/2突变引起的同源重组 (HR) 缺陷的乳腺癌和卵巢癌。也有临床证据表明PARPi在无BRCA突变的乳腺癌和卵巢癌中具有一定效用，但潜在机制尚不清楚。
摘要部分
在这里，作者报告了去泛素化酶USP15通过调节HR影响癌细胞对PARPi的反应。从机制上讲，USP15被 MDC1 募集到DNA双链断裂 (DSB)，这需要MDC1的FHA结构域和USP15的磷酸化Ser678。随后，USP15去泛素化BARD1 BRCT域，并促进 BARD1-HP1γ相互作用，导致BRCA1/BARD1保留在DSB。USP15基因敲除小鼠在体内表现出基因组不稳定性。此外，与癌症相关的USP15突变，随着USP15-BARD1相互作用的减少，增加了癌细胞中PARP抑制剂的敏感性。因此，作者的结果确定了一种新的同源重组（HR）调节剂，它是在癌症中使用PARP抑制剂进行治疗的潜在生物标志物。
研究内容
1.USP15能够调节同源重组
作者首先发现CRISPR对USP15的敲除（KO）使癌细胞对DNA损伤剂敏感。不仅如此，WT USP15的回补抑制了USP15敲除导致的DNA损伤敏感性。为了进一步探究USP15是否在DSB修复中起作用，作者研究了IR诱导的USP15-KO细胞中γH2AX病灶的形成。USP15的敲除导致自发γH2AX病灶形成水平升高。此外，与对照细胞相反，在IR后 24小时，USP15的抑制导致持续的γH2AX病灶，表明USP15有助于DNA损伤修复。接下来，作者使用HR和 NHEJ56的综合报告基因检测研究了USP15如何促进DNA修复。作者观察到USP15-KO 细胞中HR显着受损。相反，作者观察到NHEJ效率略有增加。USP15 KO还导致对PARP抑制剂的超敏反应，表明USP15在HR途径中的重要作用。
研究结论：USP15调节同源重组 (HR) 和乳腺癌对聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 抑制剂的反应
2.USP15在DNA末端切除中发挥作用
为了检查USP15在HR中的作用，作者探究了USP15-KO细胞中紫外线 (UV) 激光微辐照诱导的DNA损伤处几种DDR因子的积累。USP15缺乏导致BARD1、BRCA1、RPA和RAD51的积累受损。相比之下，USP15不影响BARD1/BRCA1上游调节因子的募集，对DSB的53BP1募集也没有影响。USP15主要影响BARD1/BRCA1在晚期时DSB的保留。先前的研究报告称，BRCA1缺陷细胞中53BP1的缺失通过恢复HR效率逆转了它们对PARP抑制剂的敏感性。作者还发现USP15敲除细胞中53BP1 的敲低恢复了HR效率，以及PARP抑制剂敏感性。
研究结论：USP15通过其对BARD1/BRCA1的影响来调节DNA末端切除。
3.USP15通过其C端与BARD1相互作用
USP15影响BARD1向DSB的募集，作者接下来检查了USP15是否可以与BARD1相互作用。作者使用针对USP15或BARD1的抗体进行了免疫共沉淀实验。内源性USP15和BARD1在细胞中相互关联。另一方面，在IR、HU、MMC或CPT处理后，USP15-BARD1相互作用增加。USP15的氨基末端包含DUSP结构域，中间包含两个UBL结构域，以及羧基末端。作者接下来通过在HEK293T细胞中表达BARD1和USP15或其突变体来测试USP15的哪个区域与BARD1相互作用。USP15缺失突变体消除了USP15与BARD1的结合。类似地，作者产生了BARD1的缺失突变体。BARD1的USP15结合区被定位到C端BRCT域。另一方面，作者证实USP15-BARD1相互作用对于HR和癌细胞对PARP抑制剂的反应是必不可少的。
研究结论：USP15通过其C端区域与BARD1 BRCT结构域相互作用。
4.USP15去泛素化BARD1 BRCT结构域
作者用 WT USP15或USP15-C269A突变体在USP15-KO细胞中重新表达。WT USP15而非C269A恢复了HR和PARP1抑制剂反应，也恢复BRCA1、BARD1、RPA和 RAD51病灶的形成在USP15敲除的细胞中。这些结果表明USP15的去泛素化酶活性是其在HR中发挥作用所必需的。由于USP15与BARD1相互作用，作者认为BARD1是USP15的主要靶标。DNA损伤后BARD1泛素化略有下降，而在USP15敲低的细胞中，基础BARD1泛素化水平没有下降。因为BARD1的C端对其在HR中的功能很重要，作者随后研究了USP15是否在体外和体内去泛素化BARD1 BRCT域。作者纯化了GST-USP15 WT或GST-USP15C269A突变体，并进行了体外去泛素化试验。 USP15从BARD1的BRCT域中去除了K63，但不去除K48连接的泛素链。有趣的是，BARD1 BRCT域泛素化在DNA损伤后显着降低。此外，在缺乏USP15的细胞中，BARD1 BRCT域泛素化不再减少。以上结果表明USP15通过在BRCT域靶向BARD1来调节HR。
由于USP15在DSB上调节BARD1/BRCA1保留，作者想阐明潜在的机制。作者首先证实了USP15没有通过 RAP80起作用。BARD1和poly-PAR之间的相互作用在USP15敲低的细胞中也不受影响。作者还研究了USP15-KO细胞中的BARD1-HP1γ相互作用。敲除USP15降低了细胞中BARD1-HP1γ的相互作用，这种作用取决于USP15去泛素化酶活性。更重要的是，作者通过USP15制备了去泛素化的 BARD1-BRCT结构域，并在体外检测了它与HP1γ蛋白的相互作用。USP15在体外去泛素化了BARD1 BRCT结构域，并促进了BARD1-HP1γ相互作用。
研究结论：BARD1在DNA损伤位点的保留是由USP15通过在 BRCT域去泛素化BARD1来调节的。
5.USP15在Ser678处磷酸化并被招募到DSB
作者接下来探究了USP15本身是否以及如何受到调控。IR后USP15在共济失调毛细血管扩张突变（ATM）共有SQ/TQ位点被磷酸化。在Atm缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 中未检测到磷酸-SQ/TQ 信号，表明USP15以 ATM依赖性方式磷酸化。之前的研究表明，USP15的Ser678在DNA损伤后被ATM磷酸化。Ser678的突变消除了ATM依赖性USP15磷酸化，表明Ser678是USP15的主要ATM磷酸化位点。
在DNA损伤之前，USP15分布在细胞核和细胞质中，大部分信号在细胞质中。IR诱导USP15易位到细胞核。作者接下来想探究USP15磷酸化是否影响其在细胞中的定位。作者发现磷酸化的USP15被募集到DSB，而通过ATM消除其磷酸化的 S678A突变体不能被募集到DSB。从机制上讲，USP15在DNA损伤时与MDC1共定位，并且MDC1的敲低降低了USP15向DSB的募集。更重要的是，USP15与 MDC1相关，并且这种相互作用在DNA损伤后增加。
先前的研究表明，MDC1包含结合磷酸SQ/TQ基序的FHA域和BRCT域。作者发现 MDC1-FHA 结构域结合磷酸化的USP15，并且Ser678磷酸化对于这种结合是必不可少的。
研究结论：USP15被ATM磷酸化，并被MDC1募集到DNA损伤位。
6.USP15磷酸化对其在同源重组中的功能至关重要
先前的研究表明USP15 Ser678在子宫内膜癌患者中发生突变。为了探究USP15磷酸化如何影响细胞对DNA损伤的敏感性，作者用异位表达的WT USP15或USP15 S678A 突变体重建了USP15-KO 细胞。USP15的敲低增加了 PARP抑制剂的敏感性，用WT USP15重新表达可以逆转这种影响。与该结果一致，WT USP15，而非USP15 S678A 突变体，恢复了HR效率，以及 BRCA1、BARD1、RPA 和 Rad51 病灶的形成。此外，ATM抑制剂（Ku55933）处理也抑制了DNA损伤时USP15介导的BARD1去泛素化。
研究结论：USP15磷酸化对其在HR中的功能至关重要。
7.USP15-KO小鼠显示基因组不稳定
作者在C57BL/6J品系中产生了USP15-KO小鼠。作者发现USP15-/-小鼠生长迟缓。5个月大的Usp15-/-小鼠的平均体重，与野生型小鼠相比体重减少20%。USP15-/- MEF显示出更多的自发性DNA损伤且具有更多的γH2AX病灶。为了探究USP15表达的丧失是否会使小鼠对IR过敏，所有USP15-/-小鼠在辐照后17天内死亡，而70%的USP15+/+和45%的USP15+/-照射后1个月小鼠仍然活着。USP15-/-小鼠组织显示出更多的γH2AX信号。在细胞层面，Usp15-/- MEF在IR后 BARD1、RPA和RAD51病灶形成被抑制，并且也对CPT、MMC或AZD2281过敏。作者还探究了USP15+/+和USP15-/- MEF的中期传播。未经处理的USP15-/- MEF与野生型MEF相比，显示自发的单染色单体断裂增加了近3倍，表明USP15-/-细胞中基因组稳定性存在内在缺陷。
研究结论：USP15在体内DSB修复中发挥作用。
8.USP15的癌症相关突变导致同源重组缺陷
先前的研究表明，USP15 Ser678在子宫内膜癌患者中发生了突变。作者证实USP15 S678磷酸化对其在HR和基因组稳定性方面的功能至关重要。作者还根据公共数据库癌症基因组图谱 (TCGA)调查了乳腺癌患者中其他潜在的USP15突变。作者在乳腺癌患者的C端D3区域鉴定了USP15的两个突变（M861V和D967H）。作者证实该区域负责BARD1结合。作者用异位表达的WT USP15或USP15 M861V/D967H突变体重建USP15-KO细胞。WT USP15（而非USP15M861V/D967H 突变体）恢复了HR效率，以及BARD1、RPA和RAD51病灶的形成。USP15 M861V/D967H 突变体对PARP1抑制剂更敏感。在分子水平上，USP15M861V/D967H 破坏了USP15-BARD1 相互作用并且未能在BRCT域中去泛素化 BARD1。
作者接下来研究了USP15在其他癌细胞系中是否失调。TCGA-ACbC队列表明USP15基因在16.67%的乳腺癌患者中深度缺失。此外，人胰腺癌细胞系拷贝数变化的整合分析表明，胰腺癌细胞系中USP15的选择性下调。作者还证实USP15在许多胰腺癌细胞系中下调。
研究结论：USP15的癌症相关突变导致同源重组缺陷。
结论与讨论
作者证明USP15调节HR和癌细胞对PARP抑制剂的反应。从机制上讲， USP15促进了BARD1/BRCA1在DBS的保留，从而促进了DSB末端的切除。因此，USP15对体内的DNA损伤修复至关重要。此外， USP15C端在乳腺癌患者中发生突变，破坏了USP15-BARD1的相互作用，导致HR缺陷。因此，USP15加作为影响HR和PARP1抑制剂反应的蛋白质之一，对控制和调节DNA末端切除具有一定的作用。
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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-09232-8
