Nature丨新抗原靶向CD8+T细胞应答是PD-1治疗关键
免疫治疗，是继手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的又一个抗肿瘤手段，在带来部分肿瘤患者长期治愈的同时，我们也需要知道，很多患者其实是无缘肿瘤免疫治疗的。那如何有效进行免疫治疗获益人群的细分，就显得尤为重要。本文就Nature期刊上最新刊发的文章，阐述肿瘤和血液中CD8+T细胞克隆多样性是免疫治疗的关键。
——摘 要——
新抗原是源自可以被抗肿瘤T细胞识别的人类白细胞抗原（HLA）的非同义突变的肽段。大量的HLA等位基因多样性和有限的临床样本限制了对患者治疗过程中新抗原靶向T细胞反应的研究。本文研究团队应用了最近开发的技术，从转移性黑色素瘤患者（无论是否对抗PD-1免疫治疗有反应）的血液和肿瘤中捕获新抗原特异性T细胞，生成了新抗原-HLA个性化库，以单细胞分离技术分离T细胞并克隆其T细胞受体（neoTCR）。来自7名具有长期临床反应的患者的样本中，具有不同新TCR序列的多个T细胞（T细胞克隆型）识别出数量有限的突变。随着时间的推移，在血液和肿瘤中反复检测到这些新TCR克隆型。来自四名对抗PD-1无反应的患者的样本也显示：血液和肿瘤中的新抗原特异性T细胞对有限数量的TCR多克隆性突变的反应较低，并且在连续样本中没有反复检测到。使用非病毒CRISPR–Cas9基因编辑重建供体T细胞中的新TCRs显示了对患者匹配的黑色素瘤细胞系的特异性识别和细胞毒性。因此，有效的抗PD-1免疫疗法与肿瘤和血液中存在多克隆CD8+T细胞有关，这些细胞具有有限数量的免疫显性突变，随着时间的推移，这些突变会被反复识别。即实际上新抗原特异性的癌症免疫反应针对的只是数量有限突变（范围为3至13）。
研究团队招募了11名接受过PD-1抑制剂治疗的黑色素瘤患者。其中患者1到患者7从免疫治疗中获得了持久的益处，生存时间在32个月到111个月之间，而且到本研究结束时所有患者依然存活；患者8到患者11，对免疫治疗没有反应，或者治疗后病情加重，在研究结束时这些患者都已去世。
图1. 新抗原特异性T细胞筛选和TCR克隆型鉴定
a. 从患者样本中分离新抗原特异性TCR的示意图。NeoAg，新抗原。
b.非同义突变数量的表示、筛选突变、预测新抗原HLA复合物在对抗PD-1治疗有应答（患者1-7）或无应答（患者8-11）的患者中分离的新抗原特异性T细胞和新抗原特异性T细胞克隆型靶向的突变。
c.在每个患者中针对每个突变分离的新抗原特异性TCR克隆型的数量比率。数据均为平均值 ± s.d.与单独的值。n值表示不同患者的数量；n = 7（应答者）和n = 4（无应答者）。
尽管表达的突变范围很广，但T细胞识别为新抗原的突变数量变化较小，从1到13不等（图1b，扩展数据图1和补充表1）。因此，有证据表明免疫显性，即T细胞对突变新抗原的反应与突变的数量没有线性关系，而是针对一组有限的突变，这些突变在对PD-1免疫治疗有或无临床反应的患者中被识别为新抗原。
图2. 从具有对抗PD-1治疗有应答患者的TIL和PBMC中分离新抗原特异性T细胞
a. 随时间变化的肿瘤测量和患者1的样本采集。b.患者1在基线时（第−12天，左侧）和治疗时（第428天，右侧）的核磁共振成像（MRI）扫描。c.患者1中新抗原特异性T细胞随时间变化的分析。底部，mRNA表达，以绝对读数测量，并预测筛选的推定新抗原的HLA结合亲和力。T细胞靶向的新抗原以不同颜色突出显示，顶部显示了突变的基因名称、带有红色标记的点突变的新抗原序列和HLA。上图中使用了相同的色码，以显示分离的T细胞的新抗原特异性。六个顶部面板显示了TIL和PBMC中新抗原特异性T细胞随时间的演变.每个方框代表一个孤立的T细胞，每个交叉相当于十个孤立的T细胞，每个圆圈相当于100个孤立的T细胞。每种颜色代表不同的新抗原特异性T细胞克隆型。使用四舍五入法将分离的T细胞的数量归一化为100000个CD8+T细胞以绘制结果。只有与新抗原HLA结合的T细胞克隆型显示了曾经在健康供体T细胞中表达的复合物。d.与a中相同，但适用于患者2。e、 患者2在基线时（第13天，左侧）和治疗时（第56天，右侧）的计算机断层扫描（CT）。五十、 左；R、 对。f、 与c中相同，但适用于患者2。g、 与a中相同，但适用于患者6。该患者有两个靶病变；示出了最长直径的平均值。h、 患者6在基线时（第−23天，左侧）和治疗时（第84天，右侧）的CT扫描。i、 与c中相同，但适用于患者6。
图3. 对于抗PD-1治疗有反应的患者中分离的新抗原特异性TCRs的抗肿瘤活性
a–g，对健康供体T细胞进行基因修饰，用来自患者1（a–c）、患者2（d，e）和患者6（f，g）的分离新TCR替代内源性TCR，并用于表征这些新TCR的抗肿瘤活性。每个TCR的颜色代码与图2中每个T细胞克隆型的颜色相匹配。a–c，新TCR基因编辑的患者1的T细胞对自体细胞系（M495）和错配对照（M202）的特异性靶细胞杀伤（P:T比5:1；n = 4).地块分为强杀（a）、中等杀（b）或无杀（c）的TCR。%nRFP，nRFP阳性面积的百分比。d、 4-1BB在与自体（M489）或错配（M202）细胞系共培养后，患者2的CD8+neoTCR+基因编辑的T细胞中上调（n = 3). e、 自体细胞系（M489）和错配对照（M202）中患者2的neoTCR基因编辑T细胞的特异性靶向细胞杀伤（P:T比1:1；n = 4). f、 CD8+新TCR中4-1BB的上调+与预处理24小时的自体（M490）或错配（M202）细胞系共培养后，患者6的基因编辑T细胞 γ（n = 3). g、 自体细胞系（M490）中neoTCR基因编辑的T细胞和预处理24小时的错配对照（M202）靶细胞的特异性靶细胞杀伤 γ（P:T比10:1；n = 4).
图4. 从TIL和PBMC中分离新抗原特异性T细胞，以及对抗PD-1无反应的患者的新TCR抗肿瘤活性
a–c，患者9（a）、10（b）和11（c）的新抗原特异性T细胞分析。底部，mRNA表达，以绝对读数测量，并预测筛选的推定新抗原的HLA结合亲和力。T细胞靶向的新抗原以不同的颜色突出显示。患者9中预测的HLA与新抗原的结合亲和力用箭头突出显示，因为该表达被认为是阴性的。顶部面板使用相同的颜色代码，以显示分离的T细胞的新抗原特异性。每个小盒子代表一个孤立的T细胞。每种颜色代表不同的新抗原特异性T细胞克隆型。使用四舍五入法将分离的T细胞的数量标准化为100000个CD8+T细胞。仅显示了在健康供体T细胞中表达后与新抗原HLA复合物结合的T细胞克隆型。与自体（分别为M488、M485和M486）或错配（M202）细胞系共培养后，分别来自患者9（d）、10（e）和11（f）的CD8+neoTCR+基因编辑的T细胞中的d–f、4-1BB上调（n = 3). g–i，来自自体细胞系中患者9（g）、10（h）和11（i）的neoTCR基因编辑的T细胞和不匹配对照组的特异性靶细胞杀伤（P:T比5:1，n = 4例（患者9和10）；和P:T比10:1，n = 3（患者11））。使用带有Holm–Sidak调整的双尾非配对t检验计算P值，以进行与Neo12（e，f，h，i）的多重比较，以及与Neo12的双尾未配对t检验（d，g）*P < 0.05，***P<0.005，***P<0.0005，***P<0.0001。补充信息中提供了准确的P值。n值表示生物复制的数量。数据均为平均值 ± s.d.与单个值（d–f）和平均值（g–i）。所有T细胞产物都含有CD8+和CD4+基因编辑的T细胞。
参考文献
Nature. 2023 Mar 8. doi: 10.1038/s41586-023-05787-1. Epub ahead of print. PMID: 36890230.
