PCR引物二聚体过多怎么办

说下我的问题，设计完引物，PCR产物在100bp很弥散的条带，我以为是自己退火温度问题，设置梯度后也不行，发现问题出在了模板那里，优化后的模板和原始的序列不匹配，真是离了大谱。所以在设计引物之前必须要思考清楚。

模板没问题的话，就该考虑下面为问题了

第一个知乎大神

1.最好的办法就是重新设计引物，一般来说引物之间存在大量的碱基互补配对就会容易形成引物二聚体。推荐使用Primer 5进行引物设计，软件里会清晰的显示引物二聚体形成的情况。

2. 如果不想重新设计引物，可以考虑提高退火温度试一试，较高的退火温度会大大降低引物二聚体的形成。

3.减少引物的使用量，建议把加入引物的量减少一半试试，一般PCR体系里引物是过量的，减少引物的量对PCR反应影响不大，但是能一定程度上降低引物二聚体，毕竟引物少了，两对引物间两两结合的概率也就低了。

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①引物自身没设计好。引物设计的不好，自连系数过高会导致引物二聚体的出现，重新设计引物才能从根本上解决问题！

②模板。模板有问题，引物结合不上去；或者体系中模板的量少，浓度低，都会导致引物“没事干”，引物自连的可能性蹭蹭蹭的往上涨！所以要摸索出适合这对引物的最佳体系。

③Taq酶的量太多，Mg2+的浓度过高，体系的扩增性能太好了，引物的自连系数也跟着变高了，所以一个恰当适中的扩增体系是非常必要的。

④在反应结束后应尽快进行琼脂糖凝胶电泳。有的前辈已经试验过了，扩增产物在室温放置时间过长的话Taq酶会将多余的引物合成为二聚体，所以各位小伙伴要合理安排试验时间，尽量将试验一气呵成，耽搁的时间越久，试验结果的变数也就越大。

⑤以扩增产物为模板进行二次PCR，这样可以提高反应的特异性，减少引物二聚体，但是产物因为进行过反复的扩增，导致其浓度非常高，所以使用前可以进行稀释，一般100倍左右即可，但是也要因为产物的浓度进行调整啦！

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 第三个知乎大神

首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环（由 95 °C 变性步骤直接进入 60 °C 退火和延伸步骤）有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60 °C。可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为 200 nM，但如有需要，可将浓度降至 60 nM。镁的最佳浓度一般约为 3 mM。高于此浓度易形成引物二聚体。如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计（如有需要）。通常情况下，最好使用热启动 DNA 聚合酶，并在冰上进行反应。在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。