2023.7.19华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第八节课程要点

讲解了基因敲除和RNA I途径的相关内容。首先，基因敲除是一种用于研究基因功能的方法，但不能敲除必需基因。当需要研究必需基因时，可以采用RNA干扰进行基因敲下。RNA I途径是一种天然的细胞免疫机制，用于抵抗病毒入侵。它包括三种路径：sI RNA、miRNA和piRNA。在sI RNA路径中，双链RNA输入到细胞中，Dicer酶将其切割成小片段，Risk复合物将其中的单链RNA与Argonaute蛋白结合，形成一个RNA诱导靶向复合物(RISC)。RISC将单链RNA与目标mRNA配对，并切割目标mRNA，从而抑制基因转录和翻译。在工程上，可以人工合成小分子RNA并导入到细胞中，以实现RNA干扰的目的。涵盖了RNA干扰技术的基本原理、三种RNA干扰通路及其区别、RNA干扰在农业中的应用、以及RNA干扰技术的递送方式。其中，RNA干扰技术的基本原理是利用双链RNA或者hairpin RNA等外源性RNA分子在细胞内介导核酸酶识别特定靶标RNA，从而降解该RNA，达到基因沉默的效果。在RNA干扰中，有三种不同的通路：siRNA、miRNA和piRNA，它们分别用于抵御病毒、抵御反转座子和防治昆虫等。在农业中，RNA干扰技术被用于杀死昆虫，得益于昆虫体内的系统RNAi作用，该技术可通过植物细胞表达外源性RNA分子，从而导致食草昆虫死亡。此外，RNA干扰技术的递送方式是RNA干扰技术实现的关键，可通过口服、注射和基因转染等方式实现RNA分子的内源性表达。

Para转基因可能有几个有用的方面。首先，修改共生体的遗传基因可能比修改宿主生物的遗传基因更容易。其次，这可能是一个更有针对性的方法，因为共生体可能在疾病传播中扮演着特定的角色。第三，这可能是一个更环保的方法，因为修改后的共生体可能无法在宿主生物外生存。然而，Para转基因也存在潜在的挑战，如需要确保修改后的共生体不会对宿主生物或生态系统产生意想不到的影响。第三步是在Rotococcus Rodney中测试质粒，看它能否表达杀灭锥虫的基因。研究人员将一个名为Tc1的基因插入质粒中，这个基因编码一种毒素，可以杀灭锥虫。他们随后将质粒转化到Rotococcus Rodney中，并测试工程菌能否在离体实验中杀灭锥虫。结果显示，工程菌能够杀灭锥虫，表明该策略在体内可能起作用。第四步是在活体内测试工程菌，即在亲吻虫肠道中测试它们是否能够防止充血性心脏病的传播。这一步更具挑战性，因为它涉及将工程菌输送到亲吻虫肠道中，并确保它们能够在肠道中存活和繁殖。研究人员使用微注射技术将工程菌输送到亲吻虫的肠道中，并监测它们的存活和扩散。结果显示，工程菌能够在肠道中定植并减少锥虫数量，但它们并未完全清除锥虫。总的来说，该研究证明了利用共生菌杀灭亲吻虫肠道中的锥虫是控制充血性心脏病传播的一个有前途的策略。然而，需要进行更多的研究来优化工程菌在实际应用中的输送和功效。

介绍了两个关于“基因转移”（para transgenesis）的案例。

案例一：

研究人员试图通过引入改良后的微生物来控制中南美洲传播的恶性伤寒病（Chagas disease）。在这个过程中，研究人员使用了“穿梭质粒”（shuttle plasmid）的方法，从自然微生物Rotococcus Rodney eye中提取了野生型质粒，并对其进行了改良，然后将其重新引入了Rotococcus Rodney eye中。接下来，研究人员在改良后的质粒中添加了抗生素和启动子，并使用来自昆虫的抗微生物肽基因（Sir Kropen）来杀死致病菌Trapana zone。然而，这种策略可能存在缺陷，因为抗微生物肽基因可能会杀死Rotococcus Rodney eye微生物，从而使疾病恶化。最后，为了在千足虫中传播改良后的微生物，研究人员制作了假粪便，并将改良后的Rotococcus Rodney eye添加到其中，并喷洒到房屋中，以供千足虫食用。

案例二：

研究人员试图使用基因转移来控制疟疾病毒的传播。在这个过程中，他们关注的是Anafolis蚊和Plasmodium疟疾病毒。蚊子会在叮咬人类时从感染的人类中获取病毒，并将其带回到它们的肠道中。病毒在蚊子的体内繁殖，并在蚊子再次叮咬人类时传播。研究人员试图通过向蚊子中引入一种基因，以便在蚊子再次叮咬人类时杀死病毒。这种方法被称为“基因驱蚊”（gene drive），这可以通过CRISPR-Cas9技术来实现。

两个案例都是试图通过引入改良后的微生物来控制疾病传播。这是一种有前途的方法，但需要更多的研究来确定其效力和安全性。

讲了疟疾生命周期和使用基因转移技术来防治疟疾的研究。疟疾生命周期包括蚊子叮咬感染、在蚊子肠道中繁殖、进入蚊子唾液腺并在叮咬时释放到人体内感染肝细胞和血细胞等阶段。使用基因转移技术可以改变蚊子肠道内的细菌来杀死疟原虫，但之前的研究存在一些问题，如SM1肽无法扩散和细菌在蚊子肠道中生存能力差等。最终，研究者使用了另一种细菌Ceratia，通过喷洒在池塘中让蚊子食用，成功防治了疟疾。

讲了三个关于基因工程的例子和基因驱动的概念。在第一个例子中，科学家使用基因工程技术将一种细菌引入蚊子体内，使其能够抵御疟疾，并成功进行了试验。第二个例子介绍了如何使用RNAi技术来抵御寄生在蜜蜂体内的寄生螨和病毒，以保护蜜蜂和蜂巢。第三个例子是一个概念验证，讲述了如何使用基因驱动技术来制造具有有益表型的转基因蚊子，以取代野生种群。接下来，对话解释了Mendelian遗传学和基因驱动的概念。Mendelian遗传学是描述生物基因遗传方式的经典模型，而基因驱动是一种新兴技术，通过改变基因频率来迫使某些基因在大自然中传播。基因驱动是一种有潜力的技术，可以解决将转基因生物引入自然环境中的问题。它利用CRISPR技术和其他技术，通过基因传递来增加一种新基因的频率。这种技术是一种强有力的工具，可以帮助我们解决许多自然界和人类社会的问题。

讲解了两个遗传学概念：基因驱动和遗传连锁，以及CRISPR-Cas9在果蝇中进行基因驱动的实现过程。基因驱动是指通过破坏传统孟德尔遗传规律的方式，来增加特定基因遗传的机会，从而传播转基因等。遗传连锁是指某些基因在染色体上靠得很近，因此在遗传中往往是同时遗传的。而CRISPR-Cas9技术可以利用基因驱动的方式实现遗传连锁，从而在果蝇中实现基因转化，其具体实现过程是将CRISPR-Cas9等蛋白质与含有目标基因的DNA结合，通过DNA重组的方式实现基因驱动，从而在果蝇后代中实现基因转移。在基因驱动方面，研究人员尝试使用基因驱动技术来转变整个种群的基因型，但他们发现这种技术在野外环境中效果不佳，因为野外环境更为苛刻，存在更多的选择压力，而且分子机制也可能导致基因驱动失败。同时讨论了真核生物基因克隆的问题，因为真核生物的基因中有内含子和外显子的区别，所以在真核生物中克隆基因比原核生物更为困难。最后，讨论了如何在一个细胞中表达多个真核生物基因的问题，这是生物技术中常见的问题，需要使用一些特殊的构建方法来实现。

介绍了在真核生物中表达多个蛋白质的两种技巧：poly peptide和T2A peptide。poly peptide是将一个长的多肽链通过蛋白酶的作用剪成多个蛋白质，而T2A peptide是通过在多肽链中插入T2A序列，使得核糖体能够在该序列处跳过一个蛋白键，从而产生多个蛋白质。这两种技巧对于在真核生物中进行基因克隆非常有用，因为真核生物中没有类似于原核生物中的operon结构。此外，对于不同的生物种类，进行基因克隆的方法也有所不同，如在酵母菌中可以直接进行同源重组，而在哺乳动物中需要使用CRISPR等工具来增加同源重组的效率。明天的课程将继续讨论与基因编辑相关的话题，包括使用细菌来控制蚊子数量等内容。