USP21/YY1/SNHG16轴促进非小细胞肺癌的肿瘤增殖、迁移和侵袭

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院在2019年9月25日发表于Experimental & Molecular Medicine（2020IF：8.718，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Jianbing Huang教授，研究表明USP21/YY1/SNHG16轴促进非小细胞肺癌的肿瘤增殖、迁移和侵袭。

研究背景

        肺癌 (LC) 是癌症相关死亡的主要原因，85%的病例涉及非小细胞LC (NSCLC)。USP21 是去泛素化酶 (DUB) 家族的成员，可催化ubH2A的水解。USP21在非小细胞肺癌中的作用仍然未知。

摘要部分

        作者使用癌症基因组图谱数据集和生物信息学分析并确定USP21是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤发生的潜在因素。作者进一步证明USP21在NSCLC中高表达。随后，作者进行了体外和体内检测，以探索USP21对NSCLC进展的影响以及所涉及的潜在机制。USP21通过介导其去泛素化来稳定致癌基因YinYang-1(YY1)，从而促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤生长。此外，YY1转录调节SNHG16的表达。StarBase生物信息学分析也预测miR-4500靶向SNHG16和USP21。一系列体外实验表明SNHG16通过miR-4500增加USP21的表达。综上所述，USP21/YY1/SNHG16轴在促进NSCLC进展中发挥作用。因此，USP21/YY1/SNHG16/miR-4500轴可能是NSCLC治疗的潜在治疗靶点。

研究内容

1.USP21在NSCLC中过度表达

        为了了解DUB在NSCLC中的作用，作者使用癌症基因组图谱(TCGA)的肺腺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)数据集分析了LC患者中USP21的表达水平。结果表明，与邻近的正常组织相比，USP21在LC组织中过表达。为了验证TCGA分析，作者测量了42对NSCLC样本及其邻近正常组织中USP21的mRNA水平。与相邻的正常组织相比，USP21在LC组织中过度表达，从而证实了作者的初步观察结果。为了进一步证实这种表达模式，进行蛋白质印迹分析以检测USP21蛋白在LC组织和相邻正常组织中的表达。IHC分析还显示NSCLC肿瘤组织中USP21的染色比邻近组织更强。接下来，作者检查了NSCLC细胞系中的USP21表达。结果表明，与在16HBE正常肺细胞系中观察到的相比，A549、H1299、NCI-H460和NCI-H520细胞系中USP21的表达更高。

研究结论：USP21在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞中过度表达。

2.USP21促进体外细胞增殖

        作者进一步研究了USP21在NSCLC进展中的作用。选择A549和NCI-H460细胞进行USP21沉默和过表达实验。作者构建了一个USP21 siRNA并将其转染到A549和NCI-H460细胞中。通过qPCR和蛋白质印迹实验测量并证实USP21沉默的效率。此外，作者构建了一个USP21过表达质粒，发现将其转染到A549和NCI-H460细胞后，USP21显着过表达。然后使用MTT测定研究USP21在NSCLC进展中的作用。USP21过表达显着促进细胞增殖，而USP21沉默抑制细胞增殖。为了研究USP21对体内肿瘤生长的影响，作者给小鼠接种了过表达USP21的NSCLC细胞。在接种USP21过表达细胞的小鼠中，肿瘤体积和肿瘤重量显着增加。

研究结论：USP21在体外促进细胞增殖。

3.USP21促进NSCLC迁移和侵袭     

        作者通过进行transwell测定并评估A549和NCI-H460细胞中的上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白，研究USP21在NSCLC迁移和侵袭中的作用。USP21过表达显着促进细胞迁移和侵袭，而USP21沉默抑制细胞迁移和侵袭。此外，E-cadherin被USP21过表达显着下调，N-cadherin被上调。然而，通过USP21沉默，E-钙粘蛋白显着上调，N-钙粘蛋白下调。

研究结论：USP21促进NSCLC迁移和侵袭。

4.USP21通过YY1发挥致癌基因的作用

        先前的研究表明YY1参与LC进展。然而，尚不清楚USP21作为癌基因的作用是否由YY1介导。将一个USP21过表达质粒或两个USP21 siRNA转染到A549细胞中。结果表明，USP21过表达并未增加YY1的mRNA表达，但显着增加了YY1蛋白的水平。此外，USP21沉默并未降低YY1 mRNA的表达，但显着降低了YY1的蛋白质水平。这些结果表明USP21可能参与了YY1翻译后修饰的调控。为了确认YY1是否参与USP21的致癌作用，将A549细胞与USP21 siRNA和YY1过表达载体共转染。结果表明，YY1的过表达恢复了USP21沉默，抑制了细胞增殖、迁移和侵袭。体内肿瘤异种移植模型测定表明YY1敲低消除了USP21过表达诱导的肿瘤生长。在si-USP21+YY1组小鼠中也观察到了回补效应，表明USP21可能通过YY1充当癌基因。

研究结论：USP21通过YY1发挥致癌基因的作用。

5.USP21使LC细胞中的YY1去泛素化     

        因为USP21是DUB，作者检查了USP21是否可以直接与YY1相互作用和去泛素化。发现USP21与YY1结合，如免疫共沉淀(co-IP)测定和GST下拉所示，表明USP21是YY1的直接结合伴侣。由于DUB参与泛素-蛋白酶体系统，作者接下来研究了USP21对YY1稳定性的影响。A549细胞用放线菌酮处理以抑制蛋白质合成，然后用USP21 siRNA转染。结果表明USP21沉默降低了YY1的稳定性并增加了其降解。因此，作者推测USP21可能对YY1泛素化有影响。

        先前的一项研究表明，保守的DUB的活性位点中His残基的突变使它们催化失活。然后在野生型(wt)USP21或催化位点突变体USP21(USP21C221A)转染的细胞中评估YY1水平。结果显示用wt USP21而不是USP21 C221A转染的细胞增加了YY1的相对水平。为了进一步确认YY1是USP21的去泛素化底物，检查了USP21对YY1泛素化的影响。MG132用于抑制泛素化蛋白质的降解，并且表明wtUSP21而不是催化位点突变体是导致YY1偶联物减少的原因。然后将观察到的高分子量缀合物纯化并进行YY1印迹，印迹表明wt USP21而不是USP21 C221A减少了YY1泛素化。总的来说，这些发现表明USP21使LC细胞中的YY1去泛素化。

研究结论：USP21使LC细胞中的YY1去泛素化。

6.YY1通过结合其启动子区域转录激活SNHG16     

        之前的一项研究表明，lncRNA SNHG16在NSCLC患者中高表达。先前的研究还表明，YY1通过与启动子区域结合并充当转录因子来调节lncRNA的表达。因此，作者探究YY1是否会影响SNHG16表达。作者构建了一个YY1过表达质粒和YY1 siRNA，然后将它们转染到A549细胞中。结果表明，YY1过表达或USP21过表达显着增加了SNHG16的表达，而YY1沉默或USP21沉默也显着降低了SNHG16的表达。在JASPAR的帮助下，作者预测在lncRNA SNHG16的启动子区域有一个YY1的结合位点。作者研究了YY1和SNHG16之间的相互作用。wt和突变体构建体单独或与YY1表达载体一起转染到A549细胞中。双荧光素酶报告基因检测结果表明，瞬时转染后wt SNHG16的启动子活性显着增加；然而，在用SNHG16突变体转染的细胞中没有观察到变化。为了进一步研究SNHG16是否是YY1的直接靶基因，作者使用抗YY1的抗体进行ChIP分析。结果表明SNHG16启动子区域在YY1免疫沉淀的A549染色质中显着扩增；然而，在对照IgG免疫沉淀的染色质中未观察到启动子区域。接下来，作者使用包含预测的YY1结合位点的核提取物和DNA探针进行了EMSA。当DNA探针与A549细胞的核提取物一起孵育时，观察到一种特定的DNA-蛋白质复合物，并且该复合物在抗YY1抗体的存在下转移到更高的位置。

 研究结论：SNHG16是YY1的直接靶基因。

7.SNHG16通过靶向miR-4500调节USP21表达     

        与肿瘤邻近的正常组织相比，lncRNA SNHG16表达水平在肿瘤组织中显着增加。此外，与肿瘤邻近的正常组织相比，肿瘤组织中miR-4500的表达水平显着降低。线性回归相关分析结果表明，SNHG16的表达水平与miR-4500的表达水平呈负相关。如前所述，lncRNA可能充当ceRNA来调节miRNA，因此作者想探究SNHG16是否以这种方式作用于miR-4500。

        作者发现SNHG16 沉默显着增加了miR-4500，USP21 和 YY1的表达，而用 miR-4500 模拟物处理也发挥了同样的作用。使用Starbase生物信息学工具进行的分析表明，SNHG16和USP21都直接与miR-4500相互作用。为了证实作者之前的结果，作者进行了荧光素酶报告基因检测。在存在miR-4500的情况下，携带wt SNHG16或wt USP21的报告基因的荧光素酶活性大大降低，表明miR-4500可能直接结合和调节SNHG16和USP21。

研究结论：lncRNA SNHG16抵消了miR-4500以促进USP21表达。

结论与讨论

        作者发现USP21去泛素化并稳定YY1，并且YY1转录激活IncRNA SNHG16，后者进一步作为ceRNA来调节USP21。基于作者的研究结果，提出USP21-YY1-SNHG16轴在调节NSCLC细胞的恶性增殖中起着至关重要的作用。然而﹐USP21/YY1/SNHG16是否在反馈回路中发挥促癌作用需要进一步研究。总之，该研究首次确定了USP21/YY1/SNHG16/miR-4500轴在NSCLC中的作用，可能为NSCLC的治疗提供策略。

Thank you!

原文链接：https://www.nature.com/articles/s12276-019-0356-6