带你了解腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）包装流程

       前面小编带大家了解了腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体的基因递送过程，相信对AAV有了初步认识。那么AAV是如何包装得到的呢？本期咱们就来了解下AAV 的包装流程。

一、AAV 介绍

腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。典型的AAV2基因组约4800bp，包括2个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读码框（ORF）-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种不同蛋白，如AAV 生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3 等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种野生型血清型、100多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被认为是目前最适合在体（in vivo）研究基因功能的利器。

图 1、 AAV2 基因组结构示意图

二、整体包装流程

图 2、 AAV 包装实验流程图

三、实验材料

1. AAV包装系统：目的基因表达质粒（过表达、干扰等）pHBAAV-xxx、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper。

2. 菌株：大肠杆菌菌株 Stbl3。用于扩增 pHBAAV-xxx及其包装质粒。

3. AAV病毒的包装细胞株：AAV-293，生长培养基为DMEM + 10% FBS + 双抗（完全培养基）。

四、AAV包装与纯化

1．载体构建

AAV 包装之前需要构建表达目的基因的载体 pHBAAV-xxx。可以自由选择启动子、荧光标记、是否需要Cre 依赖等特点进行定制。质粒构建完成后需要转化后再使用去内毒素质粒试剂盒抽提，要求浓度不低于1μg/μl，A260/280在1.7~1.8。

2．AAV包装

  事先准备好用于包装病毒的AAV-293细胞（50-70%的汇合度，无支原体污染）和病毒质粒，转染一个10 cm培养皿，成分如下：

表1、AAV 包装过程中转染一个标准10 cm dish所需要质粒和转染试剂用量

       DMEM 需在 37℃水浴中预热，LipoFiterTM转染试剂建议恢复至室温后使用，使用前需摇匀。转染后 6 h 换新鲜培液。

3．AAV收集和纯化

转染后72 h，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用 Benonase酶消化，所得上清用Biomiga品牌纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80°C保存。AAV滴度测定采用国际标准对ITR或者WPRE元件进行qPCR绝对定量。

五、AAV 安全使用注意事项

1) AAV 相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。

2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3) 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。

4) 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5) 动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2 级别）完成。

6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

7) 实验完毕用洗手液清洗双手。

  以上就是AAV包装的具体流程了，如有相关问题或需要构建AAV，欢迎随时与我们联系。