DNA的琼脂糖凝胶电泳｜生物实验

        琼脂糖凝胶电泳是分子生物学中最常见的鉴定DNA的方法，它简便易行，只需少量DNA。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动是由电荷效应和分子筛效应所致，前者由分子所带电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及构想有关。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度取决于DNA分子的大小和构象。

具有不同相对分子质量的DNA片段泳动速度不同，DNA分子的迁移速度与其相对分子质量的对数成反比。另外DNA分子的构象也可影响其迁移速度，同样相对分子质量的DNA，超螺旋共价闭环质粒DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）迁移速度最快，线性DNA（lniear DNA）其次，开环（open circular DNA，cDNA）最慢。

        观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料溴化乙啶（EB）染色，EB分子是一种扁平分子，在紫外灯的照射下，发出红色荧光。当DNA在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就可以嵌入DNA双链的碱基之间，形成一种荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍。但是溴化乙啶是有毒的，是潜在的诱变剂，现在做实验常用4S Green核酸染料来代替，我们实验室就是用的4S Green核酸染料。它和EB一样敏感，并且与EB在琼脂糖凝胶电泳中的使用方法相同，当与dsDNA，ssDNA和RNA结合时，这种染色剂会发出绿色荧光。推荐使用非LED照明器，如蓝光LED。

        琼脂糖凝胶分离DNA的范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离不同长度的DNA，见下表。

1 实验器材

1.1 试剂

（1）5×TBE溶液：将54gTris，27.5g硼酸置于烧杯中，再加入0.5M的EDTA（pH 8.0）20mL，最后定容至1L。使用时可根据实验所需进行稀释。一般电泳需要稀释5倍或者10倍。

（2）琼脂糖：直接购置。

（3）凝胶加样缓冲液：1%TBE或者TAE。

（4）DNA相对分子质量标准样品（marker）：直接购置于生工，按照自己样品的需要用合适的marker。

（5）10× Loading Buffer缓冲液。

1.2 器材

（1）一次性手套、烧杯、移液器、移液器枪头、锥形瓶、量筒、胶头滴管、微波炉（电热恒温水浴锅）、稳压电泳仪、紫外检测仪、水平式电泳槽、电子秤、摄影设备。

（2）DNA样品（正常是PCR过的需要的样品）。

2 实验操作

    操作过程都需要穿实验服戴手套。

2.1 琼脂糖凝胶的制备

（1）洗净有机玻璃制胶内槽，置于槽内，水平备用。

（2）根据制胶槽的大小，称取一定质量所需的琼脂糖（我们是称取0.2g），放入锥形瓶中，按照所需的浓度1%～2%加入适量的1×TBE或者TAE缓冲液（我们是加入20mL1×TAE缓冲液），置于微波炉或者水浴加热至完全融化，取出摇匀，迅速加入2μL 4S Green核酸染料（加4S Green时需要用移液枪在液面以下打下去，锥形瓶立即在桌面上慢速打圈混匀，以免染色剂混不匀或者产生气泡）。

2.2 凝胶板的制备

（1）将上一步制好的琼脂糖凝胶冷却至60℃缓慢倒入制胶模槽，厚度一般为3～5mm，放好梳子，排除梳齿间或梳齿下的气泡（一般轻轻抖动梳子即可或者用干净无菌的枪头勾除）。

（2）室温放置20～30min试琼脂糖完全凝固，小心取出梳子，撤除大模槽，将胶槽置于电泳槽中，加入1×TBE或者TAE缓冲液，使液面高于胶面约1mm。注意：电泳槽缓冲液和配制凝胶的缓冲液应完全一致，最好为同一配制的溶液。

2.3 加样

取样品液和标准品DNA各5μL，样品DNA各加入2μL的10× Loading Buffer缓冲液，混匀后，用微量加样器（移液枪或注射器）将样品点入点样孔中，枪口最好不要碰孔壁。正常第一个孔什么都不加，第二个孔加DNA标准样品DNA，后面挨着加样品。

2.4 电泳

（1）接通电泳仪和电泳槽，注意DNA向正极移动，加样端要接负极。DNA的迁移速度与电压成正比，电压选择为80～90V。

（2）当样品移动到大约1/2的时候可以拿出来观察一下，移动到3/4的时候就可以停止电泳了。

2.5 观察

在紫外灯下观察电泳结果，并可将凝胶置于紫外投射仪的玻璃板上，打开紫外灯，观察结果，如果结果良好可以使用，可以用凝胶自动成像仪处理结果。

3 注意事项

3.1 琼脂糖凝胶需要现用现配，最好不要用之前配好的。

3.2 跑电泳时是由负极跑向正极，由黑跑向红，不要弄反了。

3.3 做实验时需要戴手套穿实验服，保护自己的同时也以防样品被污染。

3.4 移液枪使用之后需要调到最大量程，以免损坏移液枪。

3.5 电泳仪使用完毕之后需要关开关、把电源拔了。

4 仪器图片

以下为我们实验室用的仪器器材，其他的一样效果的仪器器材也是可以的。