如何设计用于位点定向诱变的引物

什么是定点诱变

定点诱变是一种分子生物学技术，用于将基因核苷酸序列的特定变化引入。它用于改变蛋白质的氨基酸序列，引入或去除限制性位点，破坏转录结合位点以及产生融合蛋白。

过程

在定点诱变过程中，使用引物将突变引入质粒，引物由所需的突变组成。整个模板通过PCR扩增，将突变合并到模板中。然后，使用酶，甲基化依赖性核酸内切酶从样品中除去母体模板。PCR产物或具有所需突变的切口质粒分子转化为细菌。质粒可以通过所需的修饰从细菌中分离出来。定点诱变的过程如图1所示。

图1：定点诱变

三种主要类型的方法用于在定点诱变中引入所需的突变。它们是传统的 PCR、引物延伸和反向 PCR。引物延伸和反向PCR可用于引入大规模核苷酸变化。

如何设计定点诱变引物

定点诱变是通过引物引入所需突变的过程。突变可以是替换、插入或删除。随着引物中错配核苷酸的增加，PCR的特异性降低，传统的PCR只能向靶序列引入一两个碱基对变化。引物延伸和反向PCR等其他方法可用于引入大规模突变。定点诱变中的引物设计如图2所示。

图2：用于定点诱变的引物

替代：对于置换，两个引物中的一个应在引物中间包含所需的突变。在这里，包含突变的位点不会退火到靶序列，因为它会形成扭曲。

删除：对于缺失，在引物设计过程中可以忽略要从靶标中删除的序列。由于该序列通过引物与侧翼区域分开，因此在PCR过程中不会扩增。

插入：对于插入，在引物设计过程中，要添加的序列纠缠到其中一个引物的5'末端。因此，插入的序列也可以保持附着在扩增子上。

结论

定点诱变是一种用于将突变引入DNA序列的技术。这些突变可以是替换、插入或删除。在传统的PCR中可以引入小规模突变。大规模突变可以在引物延伸或反向PCR中引入。突变的引入是通过将所需的突变掺入引物来完成的。