上清蛋白表达、纯化及鉴定

2.2 蛋白表达

1) 将上述测序正确的表达质粒转化进BL21（DE3）感受态表达菌株中。并涂布到氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板中，于37℃培养12h。

2) 从上述平板中挑取单克隆菌落至5ml含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm条件下振荡培养12h；

3) 取上述菌液3ml至800ml含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，振荡培养至OD600达到0.6~0.8左右，加入0.5mM IPTG进行诱导表达，于18℃，220rpm条件下振荡培养12h;

4) 诱导结束，菌液以4000rpm条件离心30min，弃去上清液，用30mlTBS重悬菌体沉淀；

5) 将上述菌液于冰浴条件下进行菌体破碎，超声功率为39%，超声时间为25min;

6) 超声破碎后以14000rpm离心30min，收集上清，随后用0.45um滤膜过滤，并作为纯化样品液。

2.3 蛋白纯化

1. 超纯水以3ml/min流速冲洗AKTA蛋白纯化系统；

2. 将HisTrapTM柱安装于AKTA纯化系统上，用TBS进行柱平衡，直至紫外吸收值稳定；

3. 将待纯化样品以上样器上样流速为1ml/min。上样结束后，用TBS进行平衡；

4. 分别用4%、10%、30%、60%和100%的洗脱液进行蛋白梯度洗脱，对应的咪唑浓度依次为20mM、50mM、150mM、300mM和500mM。收集各洗脱峰对应的流出液；

5. 将收集到的流出液进行SDS-PAGE实验，以鉴定目的蛋白的纯度。

2.4 蛋白透析及浓缩

1) 将纯化后的蛋白溶液稀释于TBS中至总体积为20ml，并装入透析袋中，将透析袋置于1L的TBS中，于4℃条件下搅拌过夜；

2) 将过夜透析的蛋白溶液加至100 kDa超滤管中，于4℃，400rpm条件离心直至超滤管中没有液体，向超滤管中加入1 ml TBS，缓慢吹打；

3) 将超滤管内液体收集，应用BCA试剂盒进行打蛋白浓度的测定，蛋白于-80℃条件下冻存。

2.5 脱盐

1. 综合分析各个重组蛋白的目的蛋白的表达量、目的蛋白的可溶性及目的蛋白的纯化效果，最终选定效果较优重组蛋白，通过脱盐处理去除咪唑，乳糖对机体没有伤害，可以不用去除，使用超滤管将目的蛋白进行浓缩，浓缩后的蛋白溶液使用BCA蛋白定量试剂盒测定重组蛋白的浓度。

2. 脱盐处理步骤是将脱盐柱提前平衡好，2.5ml蛋白样品上柱，3.5ml洗脱置换到PBS中。蛋白浓缩是将脱盐后的蛋白放入到超滤管中，4℃离心机，3000rpm/min离心5min多次离心直到里面的液体剩余2ml左右。取出100ul重组蛋白样品用于电镜检测，观察分析是否形成纳米颗粒。

3. 透射电镜观察铁蛋白纳米笼形成情况，观察和分析纯化的融合蛋白是否形成纳米颗粒。

2.6 SDS-PAGE（雅酶试剂盒版本）

1) 取等体积的下层胶溶液和下层胶缓冲液，各2.0/2.7/4.0ml，混匀；

2) 向步骤1的混合溶液中加入40/60/80ul的改良型促凝剂，混匀；

3) 向步骤2的混合溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5cm即可（注意：此溶液为过量，请勿全部注入，可留少许于配胶板中，以判断凝固状况），加入适量水或醇（如异丙醇、正丁醇等）覆盖于下层胶之上；

4) 待下层胶凝固后（约15min），倒去上层水或醇；

5) 取等体积上层溶液和彩色上层胶缓冲液，各0.5/0/75/1.0ml混匀；

6) 向步骤5的混合溶液中加入10/15/20ul的改良型促凝剂，混匀；

7) 向步骤6的混合溶液注入制胶玻璃板中，插入梳齿；

8) 待上层胶凝固后（约15min）。拔去梳齿即可用于电泳。

9) 将蛋白样品以3:1体积比混合变性4xbuffer，混合均匀后于98℃加热10min，离心后取上清进行电泳；

10) 电泳槽内外加入Running Buffer，将蛋白样品加入上样孔，使用Bio-Rad蛋白电泳仪进行电泳，80V电压条件下进行电泳20min，之后改为100V条件至电泳结束；

11) 凝胶电泳结束之后，使用凝胶染色液染色25min，随后使用脱色液脱色45min。待脱色完全之后使用Tanon-5200发光成像系统进行图片记录。

2.7 重组蛋白Western blot鉴定

1. 将定量后的蛋白与等体积的2xSDS电泳上样缓冲液混匀后99℃孵育变性10min，跑SDS-PAGE凝胶电泳，电泳120V跑至分离胶，换电压160V跑，直至跑到胶底。

2. 电泳结束后小心将胶块取下，切掉上层浓缩胶，将分离胶部分浸泡在转膜缓冲液中，同时安装好电转设备。

3. 取一块和胶块大小差不多的PVDF膜并放置在盛有甲醇的盒中浸泡5min，随后将PVDF膜和海绵浸泡在转模缓冲液中，采用湿转法将目的蛋白条带转移至PVDF膜上。

4. 按照海绵-PVDF膜-胶-海绵的顺序放置并驱赶气泡，“膜在正极，胶在负极”的顺序放在盛有预冷的转膜液的电泳槽内，置于装满冰冰盒中，最后开通电源开关，调节电压110V运行75min结束，转膜结束后，取出电泳槽内的PVDF膜放置在可盛有液体的盒子里，再放到摇床上用1xTBST缓冲液反复清洗3-5min，最后用5%脱脂奶粉（TBST缓冲液溶解）封闭，放置在水平摇床上室温封闭1-2h。

5. 脱脂奶粉封闭结束后，用1xTBST缓冲液将PVDF膜反复清洗3次，每次5分钟，再倒入1:1000稀释的一级抗体，室温孵育1h。

6. 一抗孵育结束后，弃掉一抗，再用TBST缓冲液洗膜3次，每次5-10min。加入1:3000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1h。

7. 二抗孵育结束后，膜用TBST缓冲液体清洗3次，每次约为10min，在膜上滴加配制的底物显色液与其反应，并用超灵敏多功能成像仪拍照分析。

2.8 透射电镜（TEM）及动态光散射（DLS）

通过TEM观察纳米颗粒的形态。简要的说，将蛋白样品滴加到铜网上，随后用磷钨酸进行染色，在100KV加速电压下进行图像观察。使用纳米粒径检测仪器检测纳米颗粒的尺寸。简要的说，将蛋白样品加入石英比色皿中，于90℃固定散射角进行粒径检测。