抗体滴度/效价、交叉反应、特异性、亲和力检测方法

抗体在实际应用之前均需对其滴度（效价）、交反反应、特异性和亲和力等进行鉴定。可溶性抗原制备的抗体可选用放射免疫分析法（radioimmune-assay, RIA)、免疫放射分析法（immuno-radiometric assay, IRMA）、酶免疫分析法（enzyme immunoassay, EIA）、荧光免疫分析法（fluorescence immunoassay, FIA）或化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）等。 免疫分析法的常用代号有：①T，为总信号的强度即OD值、每分钟计数（cpm）或发光值等；②B和F分别代表游离或结合的标记抗原（Ag*）或标记抗体（Ab*）的信号强度；③非特异性结合（non-specific binding）即在Ag*或Ab*存在下的结合讯号强度；④Bo%代表标准Ag为零（So）的结合率；⑤ED50，是B%=50的对应剂量。 1.抗体的滴度（效价）

将含抗体（Ab）的血清、培养上清或腹水液用倍比稀释法配1:500、1:1000、1:2000...1:100000…不同稀释度的溶液，然后分别加一定量的标记抗原（Ag），共同温育后分离结合的标记抗原-抗体复合物（Ag*Ab，即B）和未结合（即游离，F）的标记抗原（Ag*），测其信号强度。当B/F=1，即B/T=50%时的稀释倍数的倒数即为该抗血清、培养上清或腹水液样本所含抗体的滴度稀。释倍数越大，滴度也越高，表明该样本含有高效价的抗体。 2.交叉反应

只同免疫用的抗原（immunizing antigen, iAg, 免疫原）的一个决定簇结合的抗体称为无交叉反应抗体。能与iAg以外的其他具有1个或1个以上结构相同或近似的抗原决定簇结合的抗体称为有交叉反应的抗体；产生交叉反应的抗原称为交叉反应原（cross reacting antigen, cAg）。交叉反应的程度用交叉反应率（C%）表示，可用下公式计算：交叉反应率（C%）=ED50(cAg)/ED50(iAg)x100%。式中的ED50(cAg)为待鉴定交叉反应原50%结合时的浓度，ED50(iAg)为免疫原50%结合时的浓度。交叉反应曲线的横坐标应以物质的分子浓度(mol/L)为单位。交叉反应原的种类越少，ED50(cAg)的剂量越大，交叉反应就越小，抗体的特异性就越高。 3.特异性

抗体的特异性是指抗体结合抗原的专一性。只同抗原的一个决定簇结合、可在一级结构、同分异构体结构以及二级和三级机构上区分不同抗原的抗体称为高度专一或高度特异的抗体。特异性的高低用C%的大小来确定，C%越小，抗体的特异性越高。 4.亲和力

抗体的亲和力（affinity）是指一个单价抗体分子与相应抗原的一个决定簇结合的速度、强度和牢固度。抗原和抗体之间的结合和解离是处在动态平衡中的，如下式所示：

式中，k1为结合常数；k2为解离常数。亲和力的大小用亲和常数（affinity constant, Ka）值来表示，Ka=k1/k2。亲和常数Ka的计算最常用的方法是标准作图法：即以B/F为纵坐标，以B为横坐标作图，得到一条直线，其斜率的负数即为Ka值。Ka越大，提示一个单价抗体分子与相应抗原的一个决定簇结合的速度很快、强度很大和很牢固，不易解离。在测定和计算Ka时，除了考虑抗原抗体的作用外，反应的环境因素如pH等通过对抗原抗体之间分子键、引力和范德华引力等的影响，也不能忽视。 亲和力（avidity）是指多价抗体与具有多个抗原决定簇的相应抗原结合的总的速度、强度和牢固度，应大于而各个单价抗体和单个决定簇抗原Ka的总和。