CRISPR/Cas9介导的敲除细胞株构建protocol~

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，是现有基因编辑和基因修饰技术中效率最高、最简便、成本最的技术之一。因为这些特性CRISPR/Cas9技术已经成为当今最主流的基因编辑系统，相信研究涉及到基因功能的小伙伴们大多都听说过这项技术的“名头”。

CRISPR/Cas9系统包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA），被广泛应用于基因敲除（Knock-out）、基因敲入（Knock-in）、基因抑制、基因激活、多重编辑以及功能基因组筛选等实验中。本期内容小编将为大家带来CRISPR/Cas9技术应用最为广泛的基因敲除细胞系构建详细流程，请大家搬好小板凳就坐~

一、基因敲除原理

Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（移码突变：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。

二、基因敲除细胞株构建详细步骤

1.确定待敲除基因的靶位点

根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质及实验目的，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。

2.设计sgRNA

确定好作用的靶位点后，开始设计sgRNA序列。一般来说，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列 (Proto spacer Adjacent Motif) 前间区序列邻近基序（可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。例如spCas9蛋白的PAM序列特征为NGG(其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，小伙伴们也可选择根据序列自行设计。但目前有很多成熟的sgRNA设计网站或软件，可以一定程度预测特定序列的脱靶几率，所以学会运用网站和软件设计sgRNA非常重要，推荐网站：Lei Stanley Qi Lab（http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp）。

3.构建Cas9和sgRNA表达载体

通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具，通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中，再用包装好的病毒感染细胞。

4.实验细胞感染及基因敲除

利用慢病毒感染实验细胞，细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因进行切割，最终导致基因完全敲除或在目标位点产生突变，达到基因敲除的目的。

5.筛选敲除阳性混合克隆，检测敲除效率。

通过抗性或者荧光筛选获得多克隆阳性细胞池，由于细胞的NHEJ机制具有随机性，不同的阳性细胞可能会形成不一样的敲除类型。提取部分多克隆阳性细胞基因组通过PCR进行测序鉴定套峰位置。

注：套峰的位置一定要对应sgRNA的位置。根据套峰的“复杂度”可以大概估计编辑效率。精确的比例可以通过TA克隆来计算；或者通过T7E1实验来定量编辑效率。

6.单克隆敲除株挑选、基因敲除类型及敲除效果鉴定

通过单克隆挑选方式进行进一步的单克隆敲除株分选，再逐一鉴定敲除类型，选取与实验目的相符的细胞株进行后续实验。最精确的方法：提取增殖的部分单克隆基因组DNA进行PCR测序，测序结果可直观展示编辑位点的DNA序列；WB鉴定，用抗体直接鉴定目的蛋白是否仍有表，这是检测基因敲除效果最彻底的方法。

CRISPR/Cas9介导的敲除细胞株构建流程至此结束，后续小编还会为大家带来sgRNA设计、敲除效率鉴定方法等实用干货内容，大家感兴趣的话可以持续关注~

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