百萤 Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒实验方案
一、百萤Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒概述
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 红色荧光是AAT Bioquest研发的用于检测半胱天冬酶活性的试剂盒。半胱天冬酶在细胞凋亡和细胞信号传导中起重要作用。 Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的对于细胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鉴定为筛选靶标。半胱天冬酶抑制剂具有和其他药理学潜力。已经证明caspase 3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。我们的Amplite™荧光Caspase 3/7检测试剂盒使用Z-DEVD-ProRed™作为caspase的荧光指示剂-3活动。通过Caspase 3/7切割ProRed DEVD阻断肽残基产生强烈红色荧光ProRed，其在~620nm下荧光测量，激发~535nm。Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 红色荧光可用于测量细胞提取物和纯化酶中caspase 3/7的活性，以及筛选caspase 3/7抑制剂。该试剂盒以96孔格式每孔使用100μl试剂，提供足够的试剂进行100次分析。该试剂盒以384孔的形式每孔使用25ul试剂，提供足够的试剂进行400次分析。
二、百萤Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒实验方案
概述
用测试化合物（100μL/ 96孔板或25μL/ 384孔板）
制备细胞体积的半胱天冬酶3/7测定溶液
在室温下孵育1小时
在Ex / Em = 535 / 620nm处监测荧光强度
操作方法
1.准备细胞：
1.1对于粘附细胞：在生长培养基中将细胞在20,000至80,000个细胞/孔/ 90L下过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/ 20L，用于384孔板。
1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于培养基中，培养基浓度为80,000至200,000细胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D赖氨酸平板或20,000至50,000细胞/孔/ 20L用于384孔聚-D赖氨酸板。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的佳细胞密度。
2.准备库存解决方案：
2.1在使用前，在室温下使用组分A，B，C（如果需要，组分D和E）。
2.2如果需要，制备1mM Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液：将100μLDMSO（未提供）直接加入到Ac-DEVD-CHO小瓶（组分D）中。 该抑制剂可用于确认荧光信号强度与Caspase 3/7样蛋白酶活性之间的相关性。
注意：应将未使用的抑制剂储备液等分并在-20°C下干燥储存。
3.准备Caspase 3/7检测溶液：
将50μL200X胱天蛋白酶3/7底物储备溶液（组分A）和100μL1MDTT溶液（组分C）加入10mL测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：50μL的200X caspase 3/7底物储备液足以进行100次测定，每次测定的反应体积为100μL。 未使用的200X caspase 3/7底物储备液应等分，在-20°C干燥储存，避光。
4.运行Caspase 3/7测定：
4.1通过将10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）加入PBS或所需缓冲液中来处理细胞。 对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。
4.2将细胞板在培养箱中孵育一段所需的时间（用喜树碱处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶3/7测定溶液（来自步骤3）。
4.4将板在室温下孵育至少1小时，避光。
注1：如果需要，在室温下加入测定溶液10分钟前，将1L Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO的1mM储备液（来自步骤2.2）加入选定的样品中，以确认Caspase 3 / 7个类似的活动。
注2：如果需要，通过将5mM R110标准品（组分E）稀释到生长培养基中制备R110标准曲线，得到系列稀释的R110标准品，范围为0-50M。将100μL连续稀释的R110标准品加入含有的孔中。 在测量荧光之前的任何时间，100μLCaspase3/7测定溶液。 该标准曲线可用于测定含有胱天蛋白酶3/7的反应中产生的产物的摩尔数。
4.5在制动器关闭的情况下，以800rpm离心细胞板（特别是对于非粘附细胞）2分钟。
4.6在Ex / Em = 490 / 525nm处观察荧光增加。
数据分析
从具有细胞的那些孔值中减去具有生长培养基的空白孔中的荧光。空白孔的背景荧光根据生长培养基或微量滴定板的来源而变化。
