转录组比对软件STAR安装及使用
发现服务器上没有安装STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference)，这个转录组最常用的比对工具之一，也是我之前一直的用的转录组比对工具，今天安装一下并重新学习，好好理解之前设置的参数是否正确。
STAR是ENCODE计划(ENCyclopedia Of DNA Elements,人类基因组DNA元件百科全书计划)的御用pipeline工具，在转录组的文章中出镜率极高，别人说其准确率高，映射速度快，但需要占用大量内存，对计算资源有较高的要求。在之前Hisat2安装使用过程中，提到了2017年的一篇NC比较转录组比对工具的文章，又查了一下，这样总结的：STAT相比较TopHat和Hisat2，有较高的唯一比对率；STAR会将没有paired mapping上的reads都剔除，避免single reads比对到基因组上；并且STAR对lower-quality（包括more soft-clipped和错配碱基）比对有较高的容忍度，这对一些杂合率较高的基因组优势比较明显；这次注意到，在用GATK对RNA-Seq进行 Call Variants时，采用STAR的STAR 2-pass模式，估计以后也会用到。
下载安装软件
https://github.com/alexdobin/STAR
选择其中一个版本下载后， tar -zxvf 进行解压：
tar -zxvf STAR-2.7.9a.tar.gz
cd STAR/source
make STAR
然后这次我注意到在bin目录下有两个带有linux目录及source目录下都有STAR命令，都可以运行，我翻看之前的命令行，用的第二个里面的STAR命令，初步判断三个均可以，这次还是选用2中的STAR命令：
二、构建基因组索引Index
和Hisat2一样，需要先构建基因组索引，索引文件作用现在还只记得是在比对过程中，我们并不是把几十万条reads直接比对到基因组上去，而是和Index进行比较，使比对过程变地可行，希望等课题结束后，再回过头来好好学习一下索引文件作用的原理，先上脚本：
参数解释：
--runThreadN：线程数为10
--runMode：genomeGenerate，构建基因组索引；
--genomeDir：指定索引生成目录；
--genomeFastaFiles：指定参考基因组；
--sjdbGTFfile：指定参考基因组的注释文件；
--sjdbOverhang：这个是reads长度的最大值减1，默认是100，我不是很理解很多人分析的学习方法中都设置100，二代测序都是150bp的序列长度，我设置了149 (有时间时改一下数值比较一下对结果是否有影响);
发现有三个反斜杠“\”异常成了黄色，暂时不清楚原因，结果报错了：
其实我也不知道为啥，将运行命令行的反斜杠去掉，再试一下：
刚才的问题解决了，又报了其它错误信息：
居然是gtf文件的错误，第一次遇见这个问题，然后找原因：
我们看一下gtf的开头是CM023448.1，如下图：
我的参考基因组开头是>GWHAMMI00000001，如下图：
原来是染色体的命名方式不一样，一个是CM开头，另一个是GWHAMMI开头，我回到NCBI去下载序列文件又看了一下,居然是我之前下错文件了(从另一个数据库下载的参考基因组，两个数据库同一物种染色体编号规则不同)，之前做的工作又浪费了，重新下载，指定序列文件，30min后，成功建立索引，索引目录如下：
reads比对：
相比于Hisat2，STAR太多的参数设置了，对于模式生物还好，很多默认参数就可以，但对于我的课题研究，就得仔细看看这些参数了，着实用去了我不少时间，先上我的脚本，如下图：
我的参数设置：
未用的其它参数：
--outFilterMismatchNmax：比对时允许的最大错配数(可根据结果修改);
--outSAMmapqUnique60：将uniquelymapping reads的MAPQ值调整为60，满足下游使用GATK进行分析的需要;
--readFilesCommand：对FASTQ文件进行操作;
--readFilesIn：输入FASTQ文件的路径;
--outSJfilterReadsUnique：对于跨越剪切位点的reads（junction reads)，只考虑跨越唯一剪切位点的reads;
--alignIntronMin：最短的内含子长度设定了20，(根据GTF文件计算);
--alignIntronMax：最长的内含子长度设定了50000，(根据GTF文件计算);
--bamRemoveDuplicatesType 输出BAM文件时，STAR还可以对BAM进行一些预处理，用于去重。
四：结果如下图，
1、使用samtools查看生成的BAM文件。
samtoolsview sample_Aligned.sortedByCoord.out.bam |head -n 5
2、结果内容：
Aligned.sortedByCoord.out.bam:reads比对到基因组的位置;
Aligned.toTranscriptome.out.bam:reads比对到转录本的位置；
Log.final.out：统计了比对情况的信息,是非常重要的结果;
SJ.out.tab:splice junctions的一些信息，其中需要注意的是：对于junction的位置信息，STAR则是按照intron的起始和终止位置来定，而其他的一些软件则是按照exon的位置来决定的
附：我比较了一下star和Hisat2的结果差异，在运行时间和比对率上，star并没有表现出明显的优越性上。
参考：
https://blog.csdn.net/weixin_28913137/article/details/112281831
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