30+机构联合蛋白组学、多组学揭示透明细胞型肾细胞癌侵袭性特征

研究背景

肾细胞癌 (RCC) 是世界上诊断最多的十种癌症之一，包括多种组织学和遗传亚型。透明细胞 RCC (ccRCC) 占肾癌相关死亡的大部分。虽然局部的治疗是手术切除或消融，但晚期疾病的治疗选择受到限制。然而，靶向治疗对肿瘤抑制和个体患者的生存有不同的影响，这意味着需要更新的选择来改善患者的预后。

2023年01月09日，圣路易斯华盛顿大学医学院丁莉(Li Ding)教授领衔，近30个合作机构合作在Cancer Cell期刊（IF:38.58）发表的题为 的研究成果，文章采用多组学（组织病理学、蛋白质组学、单细胞测序、磷酸化蛋白质组学、肿瘤代谢组学以及肿瘤特异性糖蛋白组学）联合研究方法，整合来自305个肿瘤节段的组织病理学、蛋白质组学和代谢组学数据，透明细胞肾细胞癌的瘤内异质性特征以及 UCHL1 的预后价值。对侵袭性组织病理学亚型进行分子分层型，有望成为一种有效的治疗策略。

研究背景

肾细胞癌 (RCC) 的探究与基因缺陷、疾病进展和更具侵袭性的表型有关。癌症基因组图谱 (TCGA)分析突出了与患者结果相关的多种代谢途径中的肿瘤特异性变化。其中单细胞转录组学分析现在可以更高分辨率地了解 ccRCC 中的肿瘤微环境 (TME)。

为了研究与 ccRCC 患者预后相关的代谢异常，作者首先分析了 50 个肿瘤和 7 个正常邻近组织 (NAT) 的代谢组谱，随后检查了 56 个肿瘤和 15 个 NAT的验证集。按照评估 ccRCC 异质性的最新方法进行了广泛的肿瘤组织病理学评估。蛋白质组学分析也得到扩展，包括从蛋白质组学到磷酸蛋白质组学和糖蛋白质组学。这些发现应该有助于临床转化，包括阐明预期的患者结果依赖性特征和治疗目标，以帮助对 ccRCC 患者进行个性化治疗。

研究思路

研究结果

1.研究设计、队列和数据类型概述

研究将队列规模为 213 个病例，其中 40 个病例被选择用于另外多片段分析，以评估肿瘤演变。该数据集包含来自初始 (INI)、扩展 (EXP) 和 ITH 队列的 16 种不同数据类型的 305 个肿瘤样本、165 个配对 NAT 和 213 个血液正常样本（图 1A）。样本的基因组和表观遗传学特征与之前一样， 而新增的 110 个样本用于基于DIA 蛋白质组学分析（图 1A）。将 106 个选定病例的代谢组学和来自 7 个病例的 15 个肿瘤标本的RNA 测序 (snRNA-seq) 与其他多组学数据相结合，有助于研究肿瘤固有细胞群和 TME（图 1A）。同时，基于 21 个参数进行了全面的组织病理学评估，以确定低级和高级特征、空间结构和 TME。整合分子谱和组织病理学注释以表征不同的组织学特征，了解驱动 ccRCC 的分子机制，并为选择有效治疗提供参考。

图1 | ccRCC 组织病理学异质性的分子基础

2.ccRCC 蛋白质组学和 TME ITH 多段综合分析表征

为了研究组织病理学特征和分子特征之间的关联以更深入地了解 ccRCC ITH，作者生成了来自 40 名患者的 132 个肿瘤节段的多组学蛋白质组学数据，并进行了综合分析（图 2A）。根据 HGFC 的方差对案例进行排序（图 2B），作者观察到不同级别的异质性（图 2B）。总体而言，w I-ITH 组表现出高水平的免疫 ITH。

免疫呈递的异质性可能会影响免疫治疗反应，并最终导致治疗失败或治疗选择不当。基于 Panoptes 的多分辨率神经网络模型经过训练以预测基于 H&E 的免疫亚型，还提供了转录组免疫亚型数据。它们显示出免疫亚型预测的高度一致性（图 2F）。

图2 | 通过多段综合分析对 ccRCC 蛋白质组学和 TME ITH 进行表征

3.单细胞分析确定了 ITH、肉瘤样和横纹肌样的表达特征

作者通过 snRNA-seq 研究了根据某些特征选择的四个病例的 12 个肿瘤节段的转录组。作者进一步注释了这些肿瘤亚群，从 snRNA-seq 推断的 CNV 和从显微切割的横纹肌样和透明细胞区域获得的基于全外显子组测序 (WES) 的 CNV（图 3E）推断。使用这些具有代表性的基因组改变和标记表达为特征相关子集群注释提供额外的证据。

为了进一步加强和验证作者的观察结果，作者对另外两个肉瘤样细胞进行了测序snRNA-seq 整合分析（图 4B）。并通过免疫组织化学 (IHC) 验证了两个代表性病例中的 TGFBI 表达，由此作者仅在肉瘤样区域看到信号（高染色和弥散染色），而不是在传统的嵌套透明细胞区域（图 4D）。至于 C3N01287 中具有横纹肌样特征的子簇，它呈现出更高的 KIF2A、NAMPT 和 GALNT2 表达谱（图 4E），并被另一个具有横纹肌样特征的独立病例证实（图 4F）。

图3 |单核 RNA-seq 图谱识别不同的肿瘤内上皮细胞群

图4 | snRNA-seq atlas 进一步细化肉瘤样和横纹肌样组织学相关基因表达特征

4.ADNA 高甲基化 Methyl1 亚型与 BAP1 突变和与生存率低相关的各种其他特征相关

表观遗传 DNA 甲基化标记的失调被认为是致癌作用的早期，作者通过扩展队列进行探索。作者发现 235 个常见的显著 DM 探针对应于 198 个基因，与同源基因表达呈整体负相关（图 5C）。

为了了解每个甲基化亚型的特征，作者对 RNA 水平和蛋白质丰度进行了 DE 分析。最后，作者在 16 个独立的临床侵袭性病例之一中对 UCHL1 染色进行了拓扑学表征，这些病例表现出形态学异质性（图 5I），其中横纹肌样结节和高级别肿瘤分别显示强和中度 UCHL1 染色，而染色呈阴性低级别透明细胞区域（图 5J）。因此，作者能够证明 UCHL1 表达与 ITH 的协同。

图5 | DNA 高甲基化 Methyl1 亚型与 BAP1 突变和与生存率低相关的各种其他特征相关

5.ccRCC 中的关键磷酸化信号通路和激酶底物相互作用

为了识别 ccRCC 中的关键磷酸化信号通路，作者的磷酸化蛋白质组数据集包含 110 个基于 DIA 的 EXP 队列病例和 103 个基于 TMT 方法的 INI 队列病例13（图 6A）。使用来自 110 个肿瘤的变异系数 (CV) 的磷酸化事件来构建。基于肿瘤磷酸化蛋白质组学的揭示了磷酸化亚型的不同特征（图 6C）。MAPK14 和 MAPKAPK2 在 P1 中显著富集。

研究重点关注先前优先考虑的一组六个 K-S 对（图 6D）。作者通过基于 DIA 蛋白质组学的质谱法表征了用针对 MAPK、EGFR、mTOR 信号和 WEE1 的抑制剂处理的五种 RCC 细胞系的磷酸化蛋白质组。根据下游靶向底物的磷酸化水平，观察到细胞系之间抑制作用的变化。磷酸化蛋白质组学分析确定了肿瘤中激活的多个信号通路，并揭示了 ccRCC 中与独特的 K-S 对相关联的四个主要磷酸化蛋白质组学组。

图6 |ccRCC 组织中关键磷酸信号通路、激酶-底物 (K-S) 相互作用的鉴定，以及来自 RCC 细胞系的离体激酶药物抑制数据的整合

6.ccRCC 和高级别 ccRCC 特异性蛋白质糖基化的改变

癌症中细胞表面蛋白的异常糖基化会影响各种生物学功能。 在探索糖蛋白组学数据中的瘤间异质性时，作者观察到三种主要的 ccRCC 糖蛋白组学亚型（Glyco1-3，图 7E）和三个完整的糖肽簇（IPC 1-3，图 S6C）。此外，作者使用 CPTAC ccRCC 和 TCGA KIRC 队列检查了 HYOU1 表达与存活之间的关联。HYOU1 丰度只能在 CPTAC 队列中的蛋白质水平上作为潜在的预后指标，而不是在两个队列中的 RNA 水平上（图 7G），针对唾液酸化聚糖的靶向治疗可能是 Glyco2 和 Glyco3 亚型的潜在替代方法。 

图7 | ccRCC 和高级别 ccRCC 特有的蛋白质糖基化改变

7. 高级别 ccRCC 和低级别 ccRCC 的代谢特征

重新编程的肿瘤代谢是癌症的标志，肾癌与代谢组学改变密切相关。从 50 个 ccRCC 和七个 NAT 中量化了各种代谢途径中的 183 种代谢物。主成分分析 (PCA) 发现肿瘤和 NAT 之间存在明确的分离（图 8A）。作者检测到 55 种具有显著更高肿瘤特异性丰度的代谢物。此外，CH 和 CL 肿瘤的代谢特征显著不同（图 8A–8C）。

结合代谢组学和蛋白质组学分析，作者将代谢物的表达与其酶相关联，并将代谢组学与途径、分子和组织病理学特征以及临床信息相关联。研究分析抑制谷氨酰胺分解是一种潜在的癌症疗法，而 GLUL 可能是一个治疗靶点。基于描述所有可用组学层的综合特征，作者发现 50 个肿瘤中有 48 个呈现出独特的特征特征，证明了 ccRCC 中强烈的肿瘤间异质性（图 8H）。

图8 | 高级别和低级别 ccRCC 中失调的代谢

研究结论

ccRCC 是一种由组织病理学特征定义的复杂疾病，通过越来越多地使用不同的分析方法，其变异性和异质性水平不断提高。在初始 CPTAC 研究的基础上，本研究扩大了患者队列和分析，包括增强的组织病理学、多样本肿瘤的蛋白质组学、单细胞测序、磷酸化蛋白质组学分析、肿瘤代谢组学以及肿瘤特异性糖蛋白组学的首次分析。这项研究的多组学性质突出了 ccRCC 中存在的瘤间异质性。尽管存在异质性，作者还是证明了高级别肿瘤中特定蛋白质组学特征的富集，包括不同的磷酸化和糖蛋白特征，并确认了一些特征，这些特征以前与不良患者预后相关。

这项研究强调了可通过 IHC 测量 UCHL1 表达，作为具有 BAP1 突变、基因组不稳定的肿瘤的临床和治疗管理的高级别肿瘤的潜在生物标志物。作者基于对 ccRCC 的形态学评估最新进展，对ccRCC 进行了全面的组织病理学表征。糖蛋白 HYOU1 在高级别肿瘤 ccRCC 中的表达增加及其与不良生存率的相关性使其成为潜在的治疗靶点和生物标志物，并且这些相关性已在其他癌症类型中发现。值得注意的是，这一观察结果在 RNA 表达水平上无法检测到，并强调了多组学蛋白质分析在识别潜在的基于 IHC 的生物标志物方面的能力。糖蛋白的肿瘤特异性表达改变与各种癌症的侵袭性和转移潜能相关，并被认为是治疗靶点。最后，代谢组分析证实，在高级别 ccRCC 中，尿素循环中谷氨酰胺和代谢物的丰度增加，目前，这两项观察结果都被视为治疗目标。

总而言之，这项研究利用多种分析方法增强了作者对这种复杂和异质性疾病的理解。组织学异质性的观察与潜在的分子异质性密切相关，但分子异质性也超出了在可视化组织水平上观察到的异质性。这项研究也提供了丰富的数据，将作为进一步研究的宝贵资源，并描述了蛋白质组学特征，这些特征可以推动治疗研究的转化，以改善 ccRCC 患者的预后。

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本研究采用多组学（组织病理学、蛋白质组学、单细胞测序、磷酸化蛋白质组学、肿瘤代谢组学以及肿瘤特异性糖蛋白组学）技术，全面表征了ccRCC的复杂和异质性。提示组织学异质性的观察与潜在的分子异质性密切相关，这项研究也提供了丰富的数据，将作为进一步研究的宝贵资源，值得借鉴和进一步挖掘。

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（组织病理学、蛋白质组学、单细胞测序、磷酸化蛋白质组学、肿瘤代谢组学以及肿瘤特异性糖蛋白组学）

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