J ALLERGY CLIN IMMUNO｜为什么新冠大流行总是发生在冬季？

三年前的一个冬季，「新型冠状病毒肺炎」这个名词深深印在了我们脑海里，再也挥之不去，三年后的这个冬季，我们迎来了全面放开，但新冠病毒依旧没有离开。回顾这三年，不难发现每到冬天新冠就会越发猖狂。新冠病毒“看季节下菜碟”这一点，与流感病毒可以说如出一辙，但这究竟是为什么呢？

近日，马萨诸塞州眼耳医院和波士顿东北大学的研究人员于 《Journal of Allergy and Clinical Immunology》发表了题为“Cold exposure impairs extracellular vesicle swarm–mediated nasal antiviral immunity”的研究论文，这项研究对该现象做出了科学解释——冷暴露会削弱鼻腔上皮TLR3依赖性EV分泌和miR-17丰度，从而抑制抗病毒活性，此外还会降低了EV表面受体蛋白的TLR3依赖性上调，并削弱表面受体与病毒相互作用介导的抗病毒活性。

首先，作者确定了TLR3刺激是否影响鼻上皮EV分泌。Poly（I:C）是典型的TLR3激动剂，作者在原代人鼻上皮细胞（HNEpCs）中进行了一次实验，发现用Poly（I:C）刺激后5小时后开始促进EV分泌，在24小时观察到峰值释放效果，且Poly（I:C）以时间和剂量依赖的方式刺激鼻上皮EV分泌。作者接下来验证了这种效应是通过激活TLR3-IRF3信号轴介导的。在Poly（I:C）存在下，用TLR3/dsRNA复合物抑制剂预处理细胞可下调TLR3和磷酸化IRF3的蛋白表达，并对Poly（I:C）刺激的EV分泌效应产生负面影响。分泌型EV的总数与未刺激的对照组相当。然而，当用TLR3/dsRNA复合物抑制剂和IRF3激动剂KIN1148的混合物预处理细胞时，TLR3-IRF3信号轴的阻断和与TLR3的竞争性结合诱导的EV分泌的减少被完全消除。以上证明了TLR3刺激诱导鼻上皮EV分泌。

图1 TLR3刺激诱导鼻上皮EV分泌

作者先用3种不同的常见呼吸道病毒（包括冠状病毒CoV_OC43、次要组鼻病毒RV-1B和主要组鼻病毒RV-16）作为上呼吸道病原体，在原发性HNEpCs中建立了感染模型。接下来使用培养模型评估TLR3刺激的EV介导的体外抗病毒活性，发现与感染相同病毒滴度的未处理细胞相比，暴露于TLR3刺激的EV导致细胞内病毒mRNA水平显著降低，表明病毒复制受到抑制。此外，TLR3刺激的EV以剂量依赖的方式阻断病毒感染，即使是在2.5 × 109/mL的最低浓度下也分别导致38.37%、72.59%和61.51%的CoV_OC43、RV-1B和RV-16的复制抑制。

图2 TLR3刺激的EVs对呼吸道病毒表现出强大的抗病毒活性

接着，作者探讨了潜在的抗病毒机制。分层聚类分析显示，单个TLR3刺激的EV样品的miRNA表达水平彼此之间非常相关，并且与对照EV样品不同。在确认有TLR3刺激和无TLR3刺激的EVs的差异miRNA谱后，通过火山图分析数据，找出了TLR3刺激后显著上调且与抗病毒作用相关的6种miRNA。在这些miRNA中，miR-17先前被报道在URI期间抑制病毒复制，作者选择它作为作用靶机制进行了验证。将合成miR-17模拟物转染到原代HNEpCs中，miR-17模拟物的转染抑制了病毒RNA复制，显著降低了宿主细胞中CoV_OC43、RV-1B和RV-16mRNA水平。二次验证，作者使用mirV和miR-17抑制剂在TLR3刺激的EV中实现miR-17的特异性敲除。受体感染细胞中CoV_OC43、RV-1B和RV-16mRNA水平显著高于TLR3刺激的非靶向阴性对照EV，表明TLR3刺激诱导的EVs中miR-17的丰度赋予增强的抗病毒活性。

图3 TLR3刺激上调EVs中的miR-17，从而增强抗病毒活性

作者发现，与未受刺激的对照相比，TLR3刺激在转录和翻译水平上显著上调了EVs中的LDLR和ICAM-1，这表明TLR3刺激促进了EVs内表面受体蛋白的包装。接下来研究了表面受体蛋白的富集是否与TLR3依赖性EVs介导的内在抗病毒活性相关。作者发现，TLR3刺激的EV在暴露于受体宿主细胞之前在37℃下与病毒预培养1小时，对RV-1B和RV-16表现出更强的抗病毒效果。这表明TLR3刺激的EV表面受体蛋白-病毒相互作用可以通过充当诱饵来抑制病毒感染，从而防止病毒与其宿主细胞中的细胞受体结合。

图4 TLR3刺激的EV表面受体-病毒相互作用有助于抗病毒活性并防止病毒进入宿主细胞

作者设置了5℃的温度降低，在活体人鼻甲粘膜组织中进行实验，发现TLR3刺激在37℃时导致EV分泌显著增加，而32℃的低温显著损害TLR3依赖性EV分泌。接下来进行了冷暴露对TLR3刺激的EV介导的抗病毒活性的影响研究。作者分析了两种温度下TLR3刺激的EV的组成，与未受刺激的对照组相比，在37℃时TLR3刺激显著增加了EVs中miR-17的表达。在32℃的低温下孵育显著降低了TLR3依赖性miR-17的上调。表明通过TLR3信号刺激的EV分泌和抗病毒miRNA包装的增强取决于环境温度，在32℃时产生的TLR3刺激的EV的抗病毒活性降低与冷暴露诱导的miR-17的TLR3依赖性丰度受损密切相关。

图5 冷暴露会削弱TLR3依赖性EV分泌和miR-17丰度，从而抑制抗病毒活性

同样，作者继续使用上述实验方法发现与未受刺激的对照组相比，在37℃温度下TLR3刺激时，EVs中LDLR的基因和蛋白表达显著增加，而当EVs在32℃温度下孵育时，LDLR蛋白的TLR3依赖性上调显著受损。表明，冷暴露降低了EV表面受体蛋白的TLR3依赖性上调。此外，TLR3刺激EV表面受体-病毒相互作用有助于抗病毒活性并阻止病毒进入宿主细胞，作者还发现环境温度降低会影响这种作用，削弱了表面受体与病毒相互作用介导的抗病毒活性。

图6 冷暴露降低了EV表面受体蛋白的TLR3依赖性上调，并削弱了表面受体与病毒相互作用介导的抗病毒活性

综上所述，EV参与TLR3依赖性抗病毒免疫，通过EV介导的miR-17功能传递和通过表面受体（包括LDLR和ICAM-1）与病毒配体结合后的直接病毒粒子中和，保护宿主免受病毒感染。这些由TLR3刺激的EV介导的有效抗病毒免疫防御功能因冷暴露而受损，其途径是EV总分泌减少以及单个EV的microRNA包装和抗病毒结合亲和力降低，此外，冷暴露还降低了EV表面受体蛋白的TLR3依赖性上调，并削弱了表面受体与病毒相互作用介导的抗病毒活性。此研究为上呼吸道感染流行性疾病、新冠肺炎的季节性变化、在冬季传染性增强做出解释。

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091674922014233