USP18通过促进MAVS的K63连接的多聚泛素化正向调节先天抗病毒免疫

写在前面

        今天推荐的是由山东大学基础医学院在2021年5月20日发表于Nature Communications（2020IF：14.919，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Chengjiang Gao教授，研究表明USP18通过促进MAVS的K63连接的多聚泛素化正向调节先天抗病毒免疫。

研究背景

        MAVS的激活是Rig-I样受体(RLR)信号传导中的一种衔接分子，对于抗病毒免疫是必不可少的，但调节MAVS激活的分子机制尚不完全清楚。泛素化在调节MAVS的活性方面具有核心功能。

摘要部分

        在这里，作者证明了线粒体定位的去泛素化酶USP18与MAVS特异性相互作用，促进K63连接的多聚泛素化和随后的MAVS聚集。USP18上调仙台病毒(SeV)或脑心肌炎病毒(EMCV)感染后I型干扰素的表达和产生。缺乏USP18的小鼠更容易受到RNA病毒感染。USP18作为支架蛋白发挥作用，促进TRIM31的重新定位并增强TRIM31与线粒体中MAVS之间的相互作用。作者的结果表明，USP18作为MAVS介导的抗病毒信号转导的翻译后调节剂发挥作用。

研究内容

1.USP18增强MAVS的多聚泛素化       

        由于MAVS特异性定位于线粒体外膜，并受到泛素化修饰的广泛调节，作者推测线粒体中存在的DUB可以与E3泛素连接酶合作，严密调节MAVS的泛素化水平。作者利用PsortWolf软件发现13个DUB可能分布在线粒体中。为了寻找参与MAVS泛素化调节的DUB，作者将编码HA-泛素(Ub)、MAVS和13个DUB的质粒共转染到HEK293T细胞中。通过用HA抗体探测免疫沉淀物来检查MAVS的多聚泛素化水平。有趣的是，作者发现与其他DUB相比，USP18显着增强而不是降低了MAVS的多聚泛素化水平。对于其余的DUB可能从广泛的底物中去除了泛素,不具有线粒体特异性。

        USP18是一种干扰素诱导基因，受LPS28刺激。作者探究了RNA病毒感染期间USP18的表达，发现SeV感染大大增加了人THP-1细胞中的人USP18 mRNA和USP18蛋白。为了研究USP18是否与线粒体相关，作者从THP-1细胞中分离了线粒体，发现USP18在SeV感染后确实富含线粒体部分。更重要的是，作者观察到在RNA病毒感染后，USP18的蛋白质水平在线粒体中增强，而不是在ER中增强。

研究结论：USP18是一种线粒体相关蛋白，可能通过促进MAVS泛素化参与抗病毒先天免疫的调节。

2.USP18在RNA病毒感染时调节IFN-β信号     

        为了探索USP18在抗病毒信号传导中的潜在作用，作者在THP-1细胞中发现内源性mRNA的表达和USP18的蛋白质水平在用USP18特异性siRNA转染的细胞中比在用对照siRNA转染的细胞中低得多。USP18表达的siRNA敲低显着降低SeV感染后THP-1细胞中IFNB mRNA和下游CCl5 mRNA的表达。类似于用THP-1细胞获得的数据，作者观察到原代小鼠巨噬细胞中Usp18表达的siRNA敲低降低了SeV和EMCV诱导的Ifnb表达和IFN-β的产生。由于SeV和EMCV分别被RIG-I和MDA5识别，这种现象表明USP18调节RIG-I和MDA5介导的先天抗病毒信号。     

        接下来，作者从Usp18+/+和Usp18-/-小鼠制备了原代腹膜巨噬细胞。与Usp18+/+巨噬细胞相比，具有SeV的巨噬细胞导致Ifnb mRNA，Ccl5m mRNA以及IFN-β的产生减少。Usp18-/-.的感染与WT对应物相比，EMCV诱导的腹膜巨噬细胞还导致Ifnb及其下游Ccl5基因mRNA水平以及IFN-β的产生减少。从小鼠分离MEF细胞也观察到同样的结果。

        作者接下来研究了USP18对RLR介导的I型干扰素反应的影响是否与IFNAR相关。作者用抗IFNAR抗体预处理MEF细胞以阻断IFN下游基因的诱导。作者观察到用IFNAR抗体预处理仍然导致Usp18+/+和Usp18-/-细胞之间存在显着差异。此外，作者发现用小鼠重组IFN-β预处理MEF细胞会导致Usp18+/+和Usp18-/-细胞之间的差异。总的来说，这些数据表明I型IFN和IFNAR部分促进了USP18对RLR介导的信号的调节作用。

研究结论：USP18在SeV和EMCV感染后正向调节IFN-β信号。

3.USP18调节RNA病毒感染

        为了研究USP18在调节病毒感染中的作用，作者在感染SeV后使用MEF细胞中的SeV抗体测量SeV病毒蛋白。与USP18调节IFN-β信号的功能相一致， Usp18-/-MEFs与Usp18+/+ MEFs相比，SeV的病毒蛋白水平有所提高。此外，USP18在HEK293T细胞中的过表达导致pIRF3水平增加，并以剂量依赖性方式降低SeV水平。作者随后构建了Usp18+/+和Usp18-/-带有VSV-GFP的小鼠。通过ELISA分析，作者发现感染VSV后，Usp18-/-小鼠血清中IFN-β的产生明显低于Usp18+/+小鼠。此外，作者观察到Usp18小鼠在感染后出现更严重的瘫痪症状，大脑中的VSV滴度也相应提高。作者还观察到，在Usp18-/-小鼠的脾脏、肝脏和肺部，VSV的滴度和VSV-GFP蛋白都明显高于Usp18+/+小鼠。此外，Usp18-/-与Usp18+/+小鼠相比，小鼠对VSV感染的抵抗力较差，表现出明显的生存时间减少。不仅如此，苏木精-安地红染色显示，相对于Usp18+/+小鼠的肺部，感染VSV后，Usp18-/-小鼠的肺部有更大的免疫细胞浸润和损伤。

研究结论：USP18在抗RNA病毒感染的抗病毒先天性免疫中起着重要作用。

4.USP18在RLR信号通路中与MAVS相互作用

        由于USP18是一种线粒体相关蛋白并且可以增加MAVS泛素化，作者认为USP18可以靶向MAVS以调节针对RNA病毒的抗病毒先天免疫。为了研究USP18是否与MAVS特异性相互作用，作者利用Co-IP测定来检查RLR信号通路中的信号分子与USP18之间的相互作用。结果显示USP18主要与MAVS相互作用。作者发现USP18与MAVS中173aa至573aa的片段相互作用。免疫荧光测定显示Myc-USP18表现出与Flag-MAVS的共定位。USP18和MAVS之间的空间共定位和相互作用通过PLA进一步证实，其中红点显示USP18和MAVS之间相互作用的数量。当Myc-USP18与对照Flag载体共转染时没有红点，而Myc-USP18和Flag-MAVS的转染导致大量红点。值得注意的是，作者还观察到在THP-1细胞中SeV感染后USP18和MAVS之间的内源性相互作用增强，表明USP18可能在调节MAVS的活性中发挥作用。这种增强的USP18和MAVS复合物形成通过PLA测定得到进一步验证。由于MAVS位于线粒体中，作者进一步分离了线粒体部分，并观察到SeV感染后线粒体中MAVS和USP18之间的相互作用增强。

研究结论：USP18主要针对RLR信号通路中的MAVS。

5.USP18增强了MAVS的K63连接的多聚泛素化和聚集     

        接下来，作者研究了USP18是否特异性调节MAVS的泛素化水平，作者将编码USP18、泛素的质粒与RLRs通路中的信号分子一起转染到HEK293T细胞中。作者观察到USP18仅增强MAVS的泛素化水平，表明其在RLR途径中对MAVS泛素化的特异性调节。与之前的研究一致，作者的结果显示USP18过表达导致STING泛素化减少。作者接下来检查了USP18促进的MAVS中的泛素连接类型。作者观察到USP18增强了MAVS的K63连锁而不是K48连锁的多聚泛素化。

        接下来，作者通过免疫沉淀和串联泛素化结合实体(TUBE)测定分析了USP18对内源性MAVS泛素化的影响。与USP18过表达的结果一致，RAW264.7细胞中USP18的siRNA敲低导致K63连接的泛素化MAVS减少。作者还观察到Usp18-/-MEF与Usp18+/+MEF相比，在病毒感染后显示出显着更少的K63连接的多聚泛素化。如前所述，MAVS的K63连接的多聚泛素化促进其聚集，这是激活下游信号传导的先决条件。鉴于USP18增强了MAVS的K63连接的多聚泛素化，作者接下来检查了USP18是否可以促进MAVS的聚集。SDD-AGE分析表明，与对照Myc载体相比，USP18的过表达导致更多的MAVS聚集体形成。此外，作者观察到USP18与MAVS在HeLa细胞中的转染导致更多的MAVS聚集，表现出线粒体骨架长度和细胞溶胶面积减少。另一方面，与SeV感染后的Usp18+/+MEF相比，MEF显示出MAVS聚集减少。

研究结论：在RNA病毒感染期间，USP18促进了MAVS的K63相关泛素化和聚集。

6.USP18独立于酶活性调节MAVS的泛素化

        鉴于USP18是DUB，但可以有效提高MAVS的多聚泛素化水平，作者提出了两种可能的方案。首先，USP18可以稳定和增加MAVS的E3泛素连接酶的蛋白质水平，这取决于其酶活性。其次，USP18作为衔接蛋白为MAVS募集E3泛素连接酶，而不是依赖其酶活性。为了测试这些可能，作者将USP18的半胱氨酸残基64突变为丝氨酸（USP18 C64S）使其失去酶活。作者观察到MAVS和USP18之间的相互作用不受该突变的影响。此外，作者观察到USP18 C64S可以像野生型USP18一样增强MAVS的K63连接的多聚泛素化。一致地，通过SDD-AGE和免疫荧光测定，USP18 C64S导致MAVS的聚集程度与野生型USP18相当。作者还发现将USP18和USP18 C64S转染到HEK293T细胞中导致磷酸化IRF3增加，随后SeV蛋白以剂量依赖性方式减少。

研究结论：USP18增强了MAVS的K63连接的多聚泛素化和抗病毒先天免疫反应，而与其酶活无关。

7.USP18促进MAVS的K63连接多聚泛素化依赖于E3连接酶TRIM31

        作者认为USP18可能会招募E3连接酶用于MAVS的K63连接的多聚泛素化。TRIM31是唯一已鉴定的E3连接酶，可催化MAVS的K63连接的多聚泛素化。因此，作者研究了USP18对MAVS泛素化的影响是否依赖于TRIM31。作者观察到在HEK293T细胞中敲低TRIM31导致USP18抑制增强的K63连接的MAVS泛素化。此外，在Trim31+/+ MEF中USP18的过度表达导致MAVS的K63连接的多聚泛素化增强。为了进一步描述USP18和TRIM31在调节MAVS泛素化方面的关系，作者在TRIM31有无存在的情况下敲低了USP18。作者观察到在TRIM31存在下敲低USP18可以降低MAVS的K63连接的多聚泛素化水平，表明USP18的功能介导MAVS的K63连接的多聚泛素化是上游并依赖于TRIM31。作者之前的研究已经确定TRIM31在MAVS的赖氨酸残基11、311和461处催化K63连接的多聚泛素化。正如预期的那样，作者发现与WT MAVS相比，USP18不能增强MAVSK11R、K311R和K461R的K63连接的多聚泛素化。此外，作者发现在SeV感染后用WT MAVS而不是MAVS 3KR重建的MAVS KO HeLa中，USP18的敲低可能导致IFNB、CCL5和CXCL10的减少，表明USP18调节RLR介导的I型干扰素反应通过调节TRIM31催化的MAVS泛素化。

研究结论：USP18促进MAVS的K63连接多聚泛素化依赖于E3连接酶TRIM31。

8.USP18促进线粒体中MAVS和TRIM31之间的相互作用     

        作者假设USP18与TRIM31相互作用，随后增强了TRIM31和MAVS之间的相互作用。为了验证作者的假设，作者首先探究了USP18和TRIM31之间是否存在相互作用。通过Co-IP测定和免疫荧光分析，表明USP18和TRIM31之间的相互作用。更重要的是，作者观察到内源性USP18和TRIM31之间的相互作用在SeV感染后增加，表明USP18可能控制TRIM31的活性。此外，作者观察到USP18、TRIM31和MAVS通过Co-IP测定形成复合物，表明USP18可能充当MAVS和TRIM31之间的支架蛋白。     

        作者认为USP18将TRIM31招募到线粒体中以促进TRIM31和MAVS之间的相互作用。与之前的研究一致，作者观察到在SeV感染后，TRIM31在Usp18+/+ MEF中的线粒体中有效富集。然而，这种富集在Usp18-/- MEF中显着受损，表明USP18对TRIM31易位至线粒体至关重要。作者还观察到病毒感染后MAVS和TRIM31之间的相互作用在Usp18-/-中显着受损。此外，USP18的过表达可以以剂量依赖性方式增强MAVS和TRIM31之间的相互作用。

研究结论：USP18作为支架将TRIM31募集到线粒体中，以促进MAVS泛素化和聚集，从而调节抗病毒先天免疫。

结论与讨论

        综上所述，作者已经确定了一种去泛素酶USP18是在RNA病毒感染期间调节MAVS聚集的宿主因子。病毒感染后，USP18在线粒体中富集，并促进线粒体中TRIM31从细胞质中转出，以及TRIM31和MAVS之间的相互作用，从而增强TRIM31介导的K63连接的多聚泛素化和随后的MAVS的聚集。作者的研究阐明了MAVS聚集的调节机制,强调了其在先天抗病毒反应中的重要性。

Thank you!

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23219-4