Western Blot模块---综合实验

一、【实验目的】

掌握Western Blot印迹法检测蛋白质的实验技术。

二、【实验原理】

Western免疫印迹（Western Blot）广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot原理是将经过PAGE胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

三、【实验材料】

1. 试剂

（1）低分子量标准蛋白（Marker）

（2）过硫酸铵溶液(AP)：10克过硫酸铵溶于100 mL蒸馏水中(当天配制，4℃下只用1天为宜)

（3）烟草叶片

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）电泳缓冲液TBE (pH 8.3)：

30.3克Tris，144.2克甘氨酸，10克SDS,用蒸馏水溶解至1000 mL，用时稀释10倍 (4℃下保存)

（6）转膜缓冲液(20%甲醇，Tris-base 3 g/L，Glycine 14.4 g/L)

（7）TBST缓冲液(TBST 为150 mM NaCl，0.05% Tween-20，20 mM Tris-HCl pH=7.4)

（8）NC膜，滤纸，脱脂乳粉

（9）DAB显色试剂盒

2. 仪器

电泳仪，垂直平板电泳槽，台式离心机，微量进样器，电转仪，化学发光成像仪

四、【实验步骤】

1. 蛋白的提取

SDS 裂解液提取蛋白：整个操作过程必须在冰上进行。

（1）取出烟草叶片进行称量，每 0.5g 加入 1.5mL 裂解液（使用前加入PMSF 至终浓度 1 Mm / mL ）。

（2）用研杵棒将组织磨碎，冰上裂解 10min。

（3） 4℃离心，10000rpm，10min 。转移上清至新的离心管中。

2. 凝胶电泳

（1）样品制备：

将蛋白样品与 2×上样缓冲液在同一管中混匀（15μL上清+15μL 2×上样缓冲液），金属浴100℃加热 10 min， 冷却后取混合物上样。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质分子量标准。

（2）凝胶制备：

将玻璃板，样品梳清洗干净，用去离子水润洗数次，再用酒精擦拭干净，晾干；将两块玻璃板固定装好，按照以下说明制备分离胶：

向玻璃板间灌制分离胶，立即覆盖一层双蒸水以压平胶，大约半小时胶便聚合完全。 按照如下体积配制浓缩胶：

将上层双蒸水轻轻倾掉，用滤纸吸干，灌制浓缩胶，快速插入样品梳。

（3） SDS-PAGE 电泳：

装好电泳系统，加入电泳缓冲液试漏，加入电泳液；根据实验要求上样；将电流调至 10mA 进行凝胶电泳，当溴酚蓝条带到达分离胶后，将电流调大至 15mA ，直至溴酚蓝跑至凝胶底部，即可停止。

（4）转膜：

配制转膜液并预冷转膜液；

取出 PVDF 膜，在甲醇中浸泡 10s 左右，用双蒸水清洗几次；按照从下（负极）往上（正极）组装转膜装置：海绵垫、 厚滤纸、凝胶、PVDF 膜、厚滤纸、海绵垫；卸下胶板，轻轻将凝胶剥离放于转膜液中，转移至滤纸上； 4℃ 恒流 200 mA , 转膜 1h 。

（5）封闭：

转膜结束后，把 PVDF 膜小心取出，然后把 PVDF 膜放入封闭液中，室温摇床孵育 1h。

（6）一抗孵育：

封闭完毕取出 PVDF 膜，放入一抗稀释液（1 : 1000 ）中，室温孵育 1h。

（7）二抗孵育：

取出 PVDF 膜，用 1×TBST 缓冲液清洗 3 次，每次 5 min 。 然后把 PVDF膜放入二抗稀释液中，室温孵育 1 h 。

（8） ECL 显色

取出膜用 1×TBST 缓冲液清洗 3 次，每次 5 min ；按照说明书将等体积的 A、 B 工作液混匀，然后把显色液均匀的滴在PVDF 膜上，避光孵育 5min ，曝光成像，观察保存图片。

五、【结果处理】

仔细观察NC膜上显示出的条带变化，并拍照记录。