GB/T 41907-2022 英文版 肠激酶活性检测方法

GB/T 41907-2022 英文版 肠激酶活性检测方法

GB/T 41907-2022 英文版

前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。

引言
肠激酶(EC3.4.21.9)是十二指肠细胞分泌的一种可以在较宽pH范围(4.5~9.5)和较宽温度范围内切割含有4个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键(天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)的蛋白质水解酶。制定肠激酶活性检测方法的国家标准,用以推动该类工具酶的产业化,对于肠激酶的生产和使用具有重要意义。

肠激酶活性检测方法
1 范围
本文件描述了肠激酶活性检测方法的试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果计算和质量控制。
本文件适用于肠激酶活性的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4 试剂或材料
除非另有规定,本方法所用的试剂应为分析纯试剂,所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用,不宜高压灭菌的试剂应用0.22μm过滤器过滤除菌;水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 硫氧还蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)。
4.2 盐酸(HCl):量取盐酸(12mol/L)适量,加入等体积的纯化水,配制成浓度为6mol/L。
4.3 氯化钠(NaCl):固体。
4.4 氯化钙(CaCl2):固体。
4.5 反应缓冲液:50mmol/LTris-HCl,pH8.0(22℃),1mmol/LCaCl2,0.1% Tween-20。
4.6 硫氧还蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)溶液:称取硫氧还蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)约25mg,用反应缓冲液溶解并定容至25mL,配制成每毫升含1mg硫氧还蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)的溶液,紫外分光光度法检测蛋白浓度后再稀释成每毫升含0.1mg蛋白的溶液。
4.7 肠激酶溶液:称取肠激酶适量,用反应缓冲液溶解并配制成每毫升含1mg蛋白的溶液,再稀释成每毫升含0.1mg蛋白的溶液。
4.8 2×SDS凝胶加样缓冲液:量取或称取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巯基乙醇,4gSDS,0.2g溴酚蓝,20mL甘油,加水定容至100mL。
5 仪器设备
紫外分光光度计、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、电子分析天平(感量:0.0001g)。
6 试验步骤
6.1 酶切反应
取离心管8支,各加入硫氧还蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)溶液40μL,再依次分别加入肠激酶溶液0μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL,再依次分别加入反应缓冲液10μL、8μL、7μL、6μL、5μL、4μL、3μL、2μL,置于37℃±0.5℃水浴中,反应16h后,各加入50μL的2×SDS凝胶加样缓冲液终止酶切反应,分别取各反应液20μL,进行SDS-PAGE凝胶电泳。
6.2 电泳
12%SDS-PAGE凝胶电泳,电压90V~120V,当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳,取出凝胶进行染色30min,并过夜脱色至无底色。当融合蛋白电泳条带看不见时,表明此时的肠激酶量恰好能将该融合蛋白样品完全酶切,并以此反应体系作为依据计算酶活性。
8 质量控制
在重复性条件下,获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。