Chromosome walking   染色体步移技术

Walking使用目的：用于获得与已知序列相邻的未知序列。

Walking应用方面：

1.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点

2.根据基因的已知片段，EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件

注：EST（expressed sequence tags）：表达序列标签。指不同组织来源的cDNA序列。

EST是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5‘末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。

3.用于人工染色体PAC、YAC、和BAC的片段搭接

注：人工染色体， artificial chromosome （天然染色体基本功能包括复制起始点、着丝粒和端粒。人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连接起来，从而构成人工染色体）

PAC，Bacteriophage P1 vectors  ，P1派生人工染色体。   P1噬菌体载体是在P1噬菌体的基础上构建的克隆载体，用于克隆真核基因组DNA。

YAC， Yeast artificial chromosomes,YACs，酵母人工染色体。YAC是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。

BAC，Bacterial  artificial chromosomes,BACs,细菌人工染色体 ,细菌克隆载体。

4.构建图位克隆中的重叠群   

5.转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等

注：STS ，Sequence Tagged Sites，序列标记位点，是以特定引物对序列进行扩增的一类分子标记。

SCAR，Sequence-characterized Amplified Region，序列特异性扩增区。

总之，Walking用于获得与已知序列相邻的未知序列。

技术原理：根据已知基因组DNA序列分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP，Specific  Primer），与 Walking试剂盒中提供的四种经过特别设计的退火温度较低的简并引物，即AP1 、AP2、AP3 、AP4进行热不对称PCR反应。

注：AP  ,arbitrarily primer 随机引物，非特异性引物

Tail-PCR， thermal asymmertric interlaced PCR ，交错热不对称PCR。

• 通常情况下，其中至少有一种简并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。

• 如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。

注：Arbitrary degenerate prime ,AP，随机简并引物

（TaKaRa）以简并引物AP1为例：