凝胶层析的基本原理

  凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图11 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

(1) 凝胶颗粒     (2) 小分子组分

(3) 中等分子组分   (4) 大分子组分

(1) 完全排阻的大分子   (2) 中等分子

(3) 完全渗透的小分子   (4) 吸附分子

  柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。

  2. 分配系数

  分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配系数通常表示为：      

前面介绍了Vt和Vo都是可以测定的，所以测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。对于一定的层析条件，Vt和Vo都是恒定的，大分子先被洗脱出来，Ve值小，Kav值也小。而小分子后被洗脱出来，Ve值大，Kav值也大。对于完全排阻的大分子，Ve＝Vo，故Kav＝0。而对于完全渗透的大分子，Ve＝Vt，故Kav＝1。一般Kav值在0－1之间，如Kav值大于1，则表示这种物质与凝胶有吸附作用。

对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系：

Kav＝－b lg MW＋c   

其中b、c为常数，MW表示物质的分子量。