奥维森科技：蛋白组学检测送样指南
蛋白质组学（Proteomics）是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的学科，是系统生物学的重要组成部分。众所周知，合理的样本收集是关系到蛋白质组学实验结果好坏的第一步，合格的样本质量是获得优质数据的前提条件。那么蛋白质组学研究中应该如何处理样本呢？小编在此汇总多年的样本前处理经验，为大家送上蛋白质组检测送样指南干货，包教包会哦！
样本收集原则
一致性：除变量外，每组样本在取材部位、时间及处理条件等方面尽可能保持一致。
代表性：正确识别并分离关注部位，避免杂质污染。
迅速性：在样本采集、制备、冻存的过程中简化不必要的步骤，尽可能做到迅速。
全程低温：样本离体后，如有分离步骤在4℃或冰上进行，分离好的样本立即置于液氮中速冻，-80℃保存，避免反复冻融；胶点、胶条4℃保存。
样本足量：应检测要求、生物信息学分析要求及项目结果准确性等，各个类型样本的送样量及生物学重复最好大于其对应的建议量。
干冰运输：动物样本、植物样本、细胞、微生物、体液、蛋白溶液等均需干冰运输；胶点、胶条、石蜡切片等需冰袋寄送。
送样量建议
*若您的样本不在上述列表内可与小编联系哦！
不同类型样本收集流程
(一）动物组织
主要为脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等。
1、准确切除所需组织后，迅速剔除脂肪和筋皮等结缔组织，预冷PBS洗涤去除残留血液和污染物，使用干净滤纸吸干多余水分；
2、用组织剪或手术刀将组织分离成1 cm3左右的小块；
3、液氮速冻处理15min；
4、置于事先准备好的铝箔或无菌冻存管中，保存在-80℃，足量干冰寄送。
注意事项：
1、在样本收集过程中，避免反复冻融。
2、对于类似斑马鱼大脑、小鼠海马组织等单个实验动物组重量极少的情况，可根据课题需求，将多份样本混合为一个样品。
3、对于珍贵样本，建议进行样本备份。
（二）植物组织
主要为叶片、花、根、果实、种子、藻类等。
1、收集待研究组织部位，去除附着的其他组织；
2、收预冷PBS冲洗表面附着泥土或明显污染物，吸水纸吸去表面液体；
3、液氮速冻处理15min；
4、置于事先准备好的铝箔或无菌冻存管中，保存在-80℃，足量干冰寄送。
注意事项：
1、采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。
2、对多汁的果实进行取样时，为保持均一性（如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比），建议将整个果实进行研磨、冻干，粉末称重后分装。
3、根部、果实和种子推荐保存至离心管中，而不是锡箔纸包裹。
（三）体液
1、血清
1）使用红色采血管采集全血，室温静置两小时（避免剧烈晃动以免发生溶血）；
2）2000-3000 g离心10 min，取上层淡黄色血清样品置于EP管中；
3）200 uL每管分装血清样本；
4）液氮速冻，保存在-80℃，足量干冰寄送。
2、血浆
1）使用紫色采血管（EDTA抗凝剂）采集全血，轻轻颠倒5-10次混匀，静置30 min（避免剧烈晃动以免发生溶血）；
2）1300-2000 g离心10 min，取上清；
3）200 uL每管分装血清样本；
4）液氮速冻，保存在-80℃，足量干冰寄送。
注意事项：血清/血浆样本收集过程中，血液掺杂异物、剧烈震荡、离心转速过快等均可能导致溶血，因此一定要严格控制、避免溶血；选择抗凝剂时，推荐EDTA作为血浆抗凝剂。
3、唾液
1）采样前先使用清水漱口；
2）取500 uL新鲜唾液于1.5 mL无菌EP管中；
3）5000 g 4°C 离心10 min，取上清；
4）液氮速冻，保存在-80℃，足量干冰寄送。
4、尿液
1）将晨起中段尿（临床）或晨间1 h尿（动物）直接分装到离心管中，每管1 mL；
2）5000 g 4°C 离心10 min，取上清；
3）液氮速冻，-80℃保存，足量干冰寄送。
注意事项：动物1 h尿量不够，可分多次收集，如果需要收取24 h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收取；尿液放置在室温条件（4℃）不超过8 h。
（四）细胞
1、悬浮培养细胞
1）采集适量细胞悬浊液于15 mL无菌离心管中；
2）400-1000 g离心10 min收获细胞，去上清；
3）置于冰上，用预冷的PBS小心洗涤2次，400-1000 g离心10 min，去上清；
4）保留离心管底部细胞样本，液氮速冻5 min，-80℃保存，足量干冰寄送。
2、贴壁培养细胞
1）弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干剩余培养液；
2）加入预冷的PBS，平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去PBS，重复以上操作两次以洗去培养液；
3）将培养皿置于冰上，并向培养皿内加入预冷的PBS；
4）用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧；
5）移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内，400-1000 g离心10 min，去上清；
3、亚细胞器
亚细胞器类样品需要自行抽提，且抽提后建议自行定量。亚细胞器主要涵盖叶绿体、线粒体、细胞膜、细胞核以及囊泡等，可以分别采用合适的方法（密度梯度离心、试剂盒等）将亚细胞器分离后提取蛋白，-80℃冰箱保存。
（五）微生物
1、采集适量菌液于无菌离心管中；
2、3000-5000 g离心5-15 min，去上清；
3、预冷PBS洗涤菌体沉淀3次，3000-5000 g离心5-15 min，去上清；
4、液氮速冻，保存在-80℃。
（六）其他
1、石蜡切片（FFPE）
按照石蜡切片机进行切片操作，切片规格5-10 μm厚，50 mm2大小；每个样本包含20片以上切片，4℃保存，足量冰袋邮寄。
2、外泌体
需要自行抽提外泌体后自行进行WB，NTA等指标检测，并建议测定样本蛋白浓度，尽量保证蛋白量大于100 ug蛋白/样，样本-80℃保存，足量干冰寄送。
3、细胞上清
需使用无血清培养基；收集上清，1000-2000 g离心10 min，取上清；按上述条件再次离心取上清；-80℃冻存，足量干冰寄送。
4、其他硬质样本（如硬骨、牙齿等）
采集硬质样本，使用冻干机对样本进行脱水冻干；使用研磨仪将硬质样本研磨成均质粉末；液氮速冻，-80℃冻存，足量干冰寄送。
5、IP/Pull down样品
1）非变性洗脱：酸洗脱或者竞争洗脱。洗脱条件温和，一般只会洗脱抗原和与之发生结合的蛋白质复合物。
2）变性洗脱：在洗干净的protein A/G-beads中加入2×SDS上样缓冲液，沸水煮10 min；进行12.5% SDS-PAGE电泳，切取目标条带，4℃保存。采用SDT裂解液替换2×SDS上样缓冲液，可进行溶液样品的质谱鉴定工作，具体操作为：在洗干净的protein A/G-bead中加入SDT裂解液，沸水煮10min，离心取上清，-80℃保存。
注意事项：采用酸洗脱方式时，若wash buffer中含有去垢剂，在elution之前务必用不含去垢剂的wash buffer洗两遍，然后再做elution。
6、胶点/胶条
胶条或胶点等胶样本，要求考染或银染后条带肉眼可见，4℃保存，冰袋邮寄。
注意事项：银染样本要求试剂质谱兼容，且须在电泳后一周内切胶送样；务必冰袋邮寄，干冰会使得胶变脆，碎裂，影响后续实验。
通用要求
1、样本保存：样本尽可能采用1.5 mL或者2 mL离心管（进口离心管）保存，运输时采用封口膜密封离心管，并在离心管上标记清楚样本名称，按顺序整齐排列在冻存盒中。不方便存储在离心管中的体积较大的组织样本，推荐采用锡箔纸等材料仔细包装，标记清楚样本名称，按照组别整理整齐，放置在密封袋中。避免使用易碎的容器装载样本。
2、样本标记：样本名称使用字母和数字，建议双重标记，即：使用高品质油性笔在样本管上清晰地标记好样本名称，并用封口膜封口；将样本名称写在标签纸上，贴在管壁，再用透明胶带缠绕一圈，防止浸湿脱落。样本管和送样单不符则以实际样本管为准。
3、样本寄送：邮寄新鲜组织或者细胞样本时，推荐采用双层泡沫盒密封包装，盒中加入足量的干冰。所有样本建议您做好备份，防止寄送过程出现异常导致样本损坏。
常见问题
1、蛋白组学要求组内生物学重复为多少？
动、植物样本建议每组5个，最少3个生物学重复；临床样本建议每组30个，最少10个生物学重复；细胞及微生物样本建议每组不少于3个。生物重复数的不足，不构成检测的技术障碍，主要是会影响后续数据分析的可靠性，一定数量的样本才能代表总体。
2、不同样本类型是否可以同批次上机做的蛋白组学？
针对于Label free和DIA而言，样本是单独上机，不同样本之间互不影响，可以同批次上机。针对于iTRAQ/TMT而言，由于质谱信号噪音的存在，以及iTRAQ/TMT算法及其后期归一化的校正过程，会导致即使某些样本中不表达某个蛋白，即实际没有肽段被对应的标签标记上，该蛋白也会被赋予一定的定量值，造成“误解”。因此，iTRAQ/TMT不仅不适合分析不同物种（即使亲缘较近）的差异比较，也不适用于分析相同物种不同部位的差异比较。
以上就是对蛋白组学研究常见样本收集的简单介绍啦，若您对蛋白组学送样方面还有疑惑，可以联系小编哦！欢迎各位老师来咨询奥维森质谱检测服务！
