IF>10 | 前列腺癌治疗靶点新发现

前列腺癌(prostate cancer，PC) 是男性癌症相关死亡的重要原因。雄激素阻断疗法是治疗复发或转移性患者的主要治疗方法，但几乎所有患者在雄激素阻断疗法开始后的几年内都会进入所谓雄激素阻断疗法抗性期，即雄激素阻断疗法抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。

近期哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的黄小义教授团队在雄激素阻断疗法抗性前列腺癌产生机制和治疗手段方面取得了重要的进展。作者团队在之前的研究中发现miR-375在雄激素阻断疗法抗性前列腺癌病人血浆外泌体中明显增多。在这项工作中，作者发现miR-375通过调控PTPN4表达稳定了STAT3磷酸化，促进了前列腺癌的发展。基于此，作者提出利用miR-375反义寡核苷酸序列治疗CRPC的可能性并进行了初步验证，为相关疾病的治疗提供了重要的靶点。该成果于2022年8月发表于国际著名期刊《Experimental & Molecular Medicine》(IF=12.153)杂志上。

值得一提的是，该项研究使用了汉恒生物提供的miRNA过表达和敲低慢病毒载体，同时在敲低PTPN4的实验中也使用了汉恒提供的siRNA。这些工具在miR-375功能验证中起到了重要作用。

基于作者团队此前的研究，他们首先观察了miR-375在前列腺癌中的表达。结果显示，相较于癌旁组织或正常组织，癌组织中的miR-375表达明显增高。

图1. MiR-375在前列腺癌中的表达

为了进一步探究miR-375高表达对癌细胞的影响，作者尝试在两种人前列腺癌细胞系DU145和PC-3中上调和下调miR-375。首先作者借助购自汉恒生物的miRNA过表达载体pSUPER-RETRO-Puro-miR-375在细胞中过表达miR-375，结果发现细胞的增殖能力、迁移能力都得到了增强，并且凋亡显著减少。作者接着又使用了汉恒生物的miRNA封闭载体，pHB-U6-MCS-PGK-PURO-miR-375 sponge载体，，结果发现EMT相关蛋白的表达降低，而凋亡标记升高了。这说明miR-375的高表达能提高前列腺癌细胞的增殖和迁移能力，但抑制其凋亡。

图2. MiR-375促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，但抑制凋亡

为了揭示miR-375促进前列腺癌的机制，作者借助miRNA靶点预测工具，预测了miR-375的潜在靶点。作者对其中部分基因进行了验证，并发现其靶点之一，PTPN4基因，在前列腺癌组织中表达显著下降，并和miR-375的表达呈负相关，因此作者认为它可能是miR-375的靶点。利用前述的方法在细胞中敲低和过表达miR-375，PTPN4的表达量也会相应的上调或下调。这说明，PTPN4是miR-375的靶基因，miR-375通过结合其RNA抑制其表达。

图3. 在前列腺癌中，MiR-375靶向并负调控PTPN4

既然PTPN4是miR-375的靶基因，那么miR-375是否通过它来促进前列腺癌的发展呢？作者在细胞系中通过过表达PTPN4发现，PTPN4的高表达能有效抑制癌细胞增殖和迁移，并增加了其凋亡水平。而且在过表达miR-375的基础上过表达PTPN4能有效抑制miR-375对癌细胞增殖和迁移的促进作用。通过分析PTPN4下游通路，作者还发现了PTPN4影响了STAT3的磷酸化。因此，miR-375主要通过调控PTPN4-STAT3通路来调控前列腺癌的发展。

图4. MiR-37过表达促进癌细胞增殖、侵袭、迁移和抑制凋亡的作用依赖于PTPN4-STAT3通路。

为了进一步在体内验证miR-375的作用，作者通过异体移植的方法将DU145细胞移植到小鼠体内并观察其生长。作者发现miR-375过表达的细胞在体内成瘤更大，更容易迁移，而miR-375敲低的细胞则成瘤更小，不易迁移。则进一步在体内水平验证了miR-375对前列腺癌的促进作用。

图5. 体内过表达MiR-375促进肿瘤生长和转移

在清楚miR-375的作用机制后，作者进一步希望能寻找相关的治疗方法。于是作者尝试利用反义PMO（Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides）e-375i抑制miR-375的功能。结果显示，e-375i能有效抑制DU145细胞的增殖和迁移，并增加了其凋亡。这说明e-375i可作为潜在的前列腺癌治疗手段。

图6. 在DU145细胞中，E-375i抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡

接着作者在体内验证了e-375i的效果。经过实验，作者发现e-375i能在体内有效抑制肿瘤的发展，使用e-375i后，miR-375表达下降，肿瘤明显减小。这进一步说明了e-375i的治疗潜力。

图7. 体内注射E-375i抑制前列腺癌增殖

为了进一步解析miR-375的作用机制，作者继续探究了PTPN4-STAT3通路的下游因子。由于雄激素受体（androgen receptor，AR)是PTPN4-STAT3通路的下游因子，并是前列腺癌产生雄激素阻断疗法抗性的重要因子，作者就希望知道miR-375对AR有什么影响。结果发现，miR-375通过PTPN4-STAT3通路调控了AR的表达：miR-375高表达促进了AR的高表达，促进了前列腺癌的发生，进而可能导致了对雄激素阻断疗法的抗性。

图8. MiR-375通过靶向PTPN4-STAT3信号通路调控AR的表达

针对雄激素阻断疗法抗性的前列腺癌病人，作者推测通过抑制miR-375或可抑制其抗性。因此作者通过敲低miRNA-375并联合使用雄激素受体抑制剂enzalutamide，结果发现，这种方法能有效的抑制肿瘤大小。这提示我们可以使用类似的手段治疗雄激素阻断疗法抗性前列腺癌。

图9. MiR-375通过靶向PTPN4-STAT3信号通路在体外和体内调控enzalutamide耐药

经过上述实验，作者揭示了miR-375通过PTPN4-STAT3通路促进前列腺癌发生和产生耐药性的重要机制。并且作者验证了miR-375作为治疗靶点的巨大潜力，为相关前列腺癌病人的治疗提供了重要的思路。