真核表达系统—哺乳动物细胞表达系统--艾柏森生物
在正式开讲前，为大家简单补充一下表达系统，表达系统可分为瞬时、稳定和诱导表达三类：
瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。
稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。
目前哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰，表达的重组蛋白接近人源构象，因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产。
优势特点：重组DNA易转染，遗传稳定，可重复；识别并去除了内含子；具备翻译后修饰（磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠）；产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好；可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低；可用于基因治疗
那么接下来我就从哺乳动物细胞表达载体的主要元件、载体类型、高效表达载体的构建、受体细胞、外源基因导入受体细胞的方法、以及高通量筛选技术总共六个方面分别进行介绍：
一、哺乳动物细胞表达载体的主要元件
哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件：
1） 原核序列中包括：原核复制子；抗生素抗性基因；多克隆位点
2）启动子：分为两类
病毒来源:SV40（绿猴空泡病毒）；CMV（巨细胞病毒）；RSV（肉瘤病毒）；ADV（腺病毒）；LTR（逆转录病毒长末端重复序列）
细胞来源:HSP（热休克蛋白）
3）增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA,可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
常用增强子：SV40 enhancer；CMV enhancer；RSV enhancer；LTR enhancer
4)终止信号和poly A信号：功能是使转录后的mRNA能有效进行切割和加上polyA尾巴也就是多聚腺苷化，poly A增加mRNA的的稳定性
➢多聚腺苷化所需的两种序列
位于polyA下游GU丰富区或U丰富区
位于poly A上游11-30bp处的5’ –AAUAAA
5) 选择标记基因：胸苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因 (dhfr)、新霉素抗性基因(neo)和氯霉素乙酰转移酶基因(cat)
接下来带大家看一个pcDNA3的质粒载体，从图中可以看到CMV、T7和SV40的启动子，Amp氨苄和新霉素抗性基因，SV40 poly A信号等所必须的控制元件：
二、哺乳动物细胞表达载体类型
分为两类：非病毒载体（质粒）和病毒载体（腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒）等
1）非病毒载体：由真核复制信号、启动子、转录单位以及质粒片段组成，不需要包装细胞，比如pSV系列、pCDNA3等。接下来介绍一下常用的pcDNA3.1载体。
pcDNA3.1(+) 载体可用于在多种哺乳动物细胞系中实现高水平、组成型表达。包含可选标记物和多克隆位点，具有以下特点：
•具备高水平表达蛋白的巨细胞病毒(CMV)增强子启动子
• 正向 (+) 或反向 (-) 的大分子多克隆位点
• 牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号和转录终止序列用于增强mRNA稳定性
• 氨苄青霉素耐药基因和pUC复制区序列用于大肠杆菌中的选择和维持
2）病毒型载体
病毒型载体的类型：分为两类，即整合型和游离型
整合型：整合入宿主染色体随染色体复制而复制，可持续表达外源基因；安全性低，可能会整合到基因编码区导致插入诱变。如：逆转录病毒载体、慢病毒载体
游离型：不整合、生物安全性高、瞬时表达。如：腺病毒载体
接下来介绍几个常用的病毒型载体：
a. 腺病毒载体
Ad病毒颗粒的直径为70-90nm，呈20面体立体对称型，核心外层的壳体由252个壳粒亚单位组成。不同亚型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，与其致瘤性能强弱有关
下图为腺病毒的基因结构：
腺病毒基因组为双链DNA，约长36kb,Ad2基因组的早期转录区有6个独立的区域:IA(EIA)、EIB、 E2(E2A和E2B)、 E3、E4； EIA和EIB 与Ad2的启动和转化细胞密切有关； L1:晚期转录单位—结构蛋白； Ф：包装信号
腺病毒载体系统
腺病毒系统去除早期基因E1，将目的基因重组插入到E1基因的位置上，使其只有在提供E1基因产物的HEK293包装细胞中才能进行繁殖。常用腺病毒载体+HEK293细胞来生产重组蛋白。腺病毒载体系由腺病毒载体、腺病毒基因组质粒和包装细胞组成。通过穿梭质粒和包装质粒共转染进包装细胞产生携带外源基因的腺病毒。下面介绍一个常用的腺病毒系统：
AdMax腺病毒系统:通过Cre/loxP系统构建重组腺病毒载体。在转移质粒和包装质粒中都插入loxP位点,然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞。通过Cre介导两个loxP位点之间的DNA发生重组,可获得重组腺病毒,这种重组效率比一般的细胞内同源重组效率高。
腺病毒载体优点:安全性高，滴度高，容量大( 36kb)，可感染非分化细胞，可直接体内应用，原位感染组织；是目前基因治疗的最常用载体
缺点:免疫原性高，表达时间短；无组织特异性；真核细胞内筛选复杂，费时
b. 腺相关病毒载体(AAV)
腺相关病毒:线状单链DNA病毒, 缺陷型非病原性人类细小病毒，与人类疾病无关
腺相关病毒载体的优点：感染细胞范围广，可感染分裂期与分裂后期细胞；野生型病毒可定点整合；90%以附加形式存在，10%整合；免疫原性弱，可反复感染
缺点：外源基因插入容量小，<=4.7kb；缺少高效的包装细胞，制备过程复杂；随机整合，制备滴度低，存在一定的免疫反应。
c. 逆转录病毒载体
逆转录病毒是一类RNA动物病毒;基因组含有2条相同的正链RNA分子，病毒颗粒内部含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分；病毒可分为两类:泡沫病毒类群:（如人泡沫病毒(HFV)）和慢病毒类群:（HIV Ⅰ和Ⅱ型致癌病毒类群）
上图是逆转录病毒的基因组结构：ssRNA (9.2kb)
LTR ( long terminal repeat):长末端重复序列，含启动子(5')和polyA (3)信号
Φ：包装信号
结构蛋白包括核心蛋白(Gag)、逆转录酶(pol)和衣壳蛋白(env)
逆转录病毒载体系统：
逆转录病毒表达系统由逆转录表达载体、包装细胞系和辅助包膜质粒组成。
逆转录病毒载体如pLNHX等，缺失大部分病毒序列 Gag、Pol、Env，主要包括病毒整合的长末端重复序列（LTR，含启动子、增强子、整合必须序列）、包装信号，以及 MCS、IRES、Puro、GFP等载体特异元件。
主要包装细胞系整合有病毒结构基因：Gag（编码病毒的核心蛋白）、Pol（逆转录酶）、Env（病毒颗粒表面的被膜糖蛋白）等。
逆转录病毒载体的特点：
●宿主范围广泛，具有强启动子，感染效率高，被感染或转化的细胞可以持续传代
●不能整合非分裂细胞，只能包装10Kb以下的外源基因，载体与内源性逆转录病毒序列发生重组产生有复制能力的逆转录病毒，以及病毒随机整合而产生致癌的可能性
d. 慢病毒载体
慢病毒属于逆转录病毒亚属，RNA病毒；现有常用的慢病毒载体主要由猫免疫缺陷病毒（FIV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）慢病毒改造而来．目前慢病毒载体系统一般为四质粒表达系统，分别为两个包装质粒、包膜质粒和慢病毒表达质粒。
慢病毒载体在应用上具有严格的宿主范围，滴度低及HIV-1独特的致病性，限制了它作为转基因载体的应用；现在其主要应用于较难转染的细胞。如，原代细胞、干细胞、未分化的细胞、神经元细胞，效果好于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
优点:不仅对分裂期细胞有感染能力，对非分裂期细胞也有感染能力；宿主范围广；较大容量(7~8kb)；以转染方式主动感染宿主细胞，整合入基因组中以长期稳定存在。
缺点:仅整合到处于增殖状态的细胞;随机整合插入有诱变危险；组织或细胞选择性不高
三、高效表达载体的构建
构建高效表达载体被认为是提高重组蛋白表达水平的主要手段。载体构建策略常以提高重组蛋白表达水平，增加工程细胞稳定性为主要目标，例如:引入共
扩增基因、采用不同的表达调控元件组合、弱化筛选标记、改变基因排列方式等
1、基因扩增系统
二氢叶酸还原酶( dihydrofolate reductase，dhfr)系统：该系统是将目的基因和 dhfr 基因同时或分别转染 dhfr-细胞，然后加入氨甲喋呤( methotrexate，MTX) 加压扩增，最终目的基因得到大量扩增。
谷氨酰胺合成酶( glutamine synthetase，GS) 系统：GS 系统广泛用于 GS内源性表达水平很低的 NS0 和 CHO 细胞，尤其是 NS0细胞; 细胞转染 GS 及目的基因后，使用无谷氨酰胺培养基，并加入蛋氨酸亚氨基代砜(MSX) 加压筛选，使目的基因大量扩增。
2、筛选标记弱化
当外源基因整合到基因组高效转录位点，基因扩增的细胞通常具有更高的重组蛋白表达水平。增加筛选药物的浓度可提高筛选强度，但药物浓度过高常伴随着细胞生长速率降低。弱化筛选标记可有效解决这个问题。
弱化筛选标记的策略有两种:
第1种策略是突变筛选标记降低其活性。
第2种策略是降低筛选标记的表达，采用弱启动子起始筛选标记的转录最常见。
3、克服位置效应
目前，目的基因整合进入宿主细胞基因组常采用随机整合。该方法导致外源基因插入染色体的位置、拷贝数、表达水平等情况都不可预知。染色体上外源基因插入区域的状态会影响其表达，即所谓的位置效应( position effect) 。
克服位置效应目前主要有两种策略：
第1种策略是在外源基因两端引入某些转录调控元件
第2种策略是利用同源重组使外源基因定点整合进入转录活跃区，提高目的基因转录水平。
四、哺乳动物表达系统受体细胞
用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括人胚胎肾细胞HEK293、人胚胎视网膜细胞PER.C6、MDCK细胞、非洲绿猴肾细胞COS、小鼠骨髓瘤细胞NS0和Sp2 /0、仓鼠肾细胞 BHK-21 以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)等。
HEK293细胞多用于瞬时转染表达重组蛋白，NS0 和 Sp2/0 用于鼠源单克隆抗体生产。下面重点介绍四种受体细胞
（1）CHO细胞系：
CHO细胞系是哺乳动物蛋白质生产的主要细胞，适应性强，可在悬浮培养基中高密度生长，并易于适应无血清条件，但其克隆稳定性差。
CHO细胞具有不同的谱系：CHO-K1，CHO-S，CHO-DG44和CHO-DXB11，为了提高重组蛋白的产率，研究者们会对CHO进行抗凋亡以及糖工程的改造。
（2）HEK293细胞系：
HEK293细胞，又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点；293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高；293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果
（3）PER.C6细胞系：
PER.C6（Crucell）系最初是用腺病毒载体的E1小基因转染无限增殖的人视网膜母细胞产生的，可以在无血清培养基中悬浮培养至高细胞密度（最高1×107细胞/ml）。据报道，这些细胞在没有任何培养基或饲料优化的情况下很容易产生300-500 mg/L的IgG
（4）CAP/CAP-T细胞系：
CAP细胞系最初是用Ad5的E1转化原代人羊膜细胞产生的。CAP-T是该系的一个变种，组成性表达SV40大T抗原，使它们适合作为宿主，利用携带SV40 ori的质粒进行瞬时基因表达；该细胞系能够表达和分泌以前难以表达的蛋白质。其他一些蛋白（分泌的胚胎碱性磷酸酶、SEAP和激酶受体胞外结构域）的产量表明，CAP-T细胞至少与HEK 293-E细胞一样好，甚至更好，并且优于CHO细胞
五、外源基因导入受体细胞的方法
将外源基因导入哺乳动物细胞,主要有2类方法：
a.感染性病毒颗粒感染宿主细胞;
b.通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中
表中是总结的哺乳动物细胞各种异源基因转染方法，最左侧项目中“*”表示从质粒构建完成到异源基因转染到哺乳动物宿主细胞完成的时间；“￡”表示外源蛋白的表达水平；“§”表示当外源基因转染宿主细胞时，基因必须转移到细胞核来工作；“¤”表示适用于造血细胞；“#”表示不适用于造血细胞；“**”表示由于异源基因位于细胞质内游离的质粒中，目的基因能瞬时表达
六、高通量筛选技术
由于转染、外源基因整合、筛选等过程会对细胞造成不同程度的破坏，直接造成克隆的高度不均一性，而高产阳性克隆只占极少数。获取高产阳性克隆的经典方法是有限稀释法，操作简单，但耗时耗力。目前，高通量筛选技术技术已经被用于细胞克隆筛选，下面介绍两种高通量筛选技术。
1、基于荧光活化细胞分选技术(FACS) ：
FACS基本流程是荧光标记样本细胞，激发使之产生特定荧光，随后检测荧光并分析，之后使含有目的克隆的液滴带电并收集；FACS 不仅可以在高流速下监测多波长，还能同时获取细胞粒度、大小等参数。
目前，基于FACS 有几种不同的高表达细胞株筛选策略，其主要区别在荧光标记策略，常用策略有以下：
(1) 直接在载体构建时引入荧光蛋白基因；
(2) 凝胶微滴法:在生物素化的琼脂糖基质中包裹单个细胞，荧光标记的一抗结合重组蛋白，形成的复合物与固定化的二抗结合；
(3) 亲和基质吸附法:在细胞表面交联低通透性基质吸附细胞分泌的蛋白，荧光标记抗体识别目的蛋白并与之结合；
(4) 冷捕获法: 采用低温手段使正在分泌的蛋白来不及脱离细胞表面，荧光标记抗体识别并结合目的蛋白；
2、ClonePix 高效细胞克隆筛选系统
原理：借助荧光偶联抗体，通过荧光成像和精密的机械设计筛选并挑取分泌表达单体蛋白的CHO细胞和HEK293细胞，最终获得高表达目标蛋白的优质细胞株。
待(悬浮或贴壁)细胞在半固体培养基中生长成分离的克隆后，ClonePix系统通过荧光染料标记的特异性抗体(抗蛋白质本身或抗蛋白标签)对其成像。系统通过分析这些图片筛选出高表达目标蛋白的细胞克隆。ClonePix系统具有5个荧光通道，还有白光成像用于克隆识别。至多3个荧光通道可以叠加，因此可以在单次挑取中采用多种荧光探针。
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图片来源Biorender和网络
参考文献
[1] 苏鹏, 龚国利. 重组蛋白表达技术的研究进展 [J]. 中国酿造, 2016(10):9-12.
[2] Kurasawa J H, Park A, Sowers C R, et al. Chemically Defined, High-Density Insect Cell-Based Expression System for Scalable AAV Vector Production[J]. Mol Ther Methods Clin Dev, 2020, 19: 330-340
[3] Zhu J. Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(5):1158-1170.
[4] Bandaranayake A D , Almo S C . Recent advances in mammalian protein production[J]. FEBS Letters, 2014, 588(2):253-260.
[5] 王登, 刘煜. 用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞系的研究进展[J]. 药物生物技术, 2014(5):478-482
