RNA与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。

近年来，随着技术的改进和新方法的建立，RNA和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多RNA上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的RNA结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。

这些为最终探明RNA和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下实的基础。

一．RNA pull down 技术应用

1.  癌症肿瘤相关调控机制研究

LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞增值、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。

lncRNA能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加，谷氨酰胺分解增强以及脱质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数lncRNA在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解细胞中与lncRNA相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据以及新的思路和途径。

环状RNA(cicular RNA,cicRNA)是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发展，circRNA在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程。

circRNA大多数是由外显子序列组成。呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守，通过微小RNA"海绵"作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展有关。这些特性使circRNA有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关的微小RNA的结合，可以开发针对circRNA分子的靶点的靶向治疗。因为circRNA在肿瘤转化医学的研究中意义更大。 

2.  多种人类疾病研究

RBPs在转录后水平参与调控mRNA稳定性，LncRNA活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对RBPs–RNA相互作用网络的研究和鉴定意义。但由于RBPs作用方式复杂，功能多样性，作用空间位置多样化等原因，对其开展精确的研究一直是一个重大挑战。RNA领域，尤其是非编码RNA研究的快速发展，催生了多种RBPs–RNAs互相作用鉴定技术。

二．RNA pull down实验内容

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确，选择Western blot鉴定；若不明确，则可选择质谱进行鉴定。

实验流程：

1.  构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证

2.  体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板。

3.  体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA

4.  RNA pull down：通过磁珠-RNA探针复合物富集互作的蛋白

5.  银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况

6.  质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照组的差异蛋白；进而筛选可能的互作蛋白。

相关实例图：A:以构建过表达质粒为模板+设计合成好的引物，扩增得到体外转录模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增PCR产物情况，切取目的条件纯化回收备用。

B:根据银染结果来选择质谱鉴定的方式：RNA pull-down设置实验组及反义链对照组，银染找出差异条带进行胶条质谱鉴定。

1.存在肉眼可见差异条带

2.无肉眼可见差异条带

3.存在浓度差异条带

注：1：切取sense实验组泳道中的差异条带进行胶条鉴定。2：将sense实验组和antisense对照组两组蛋白液进行全谱鉴定，根据鉴定分析结果找出sense实验组中特有的蛋白，进行筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。3:也将sense实验组和antisense对照组两组蛋白液分别进行全谱鉴定，根据鉴定分析结果找出sense实验组中特有的蛋白，进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。

三．甲方提供

RNA序列或者RNA序列构建的质粒（种属）

相同种属的细胞样品

目的基因种属及ID号

样本数量

分析要求

四．最终交付

基因合成测序报告

构建含目的基因的质粒、菌液，测序报告

体外转录模版的sense&antisense引物、模版电泳图

RNA Pull-down蛋白SDS-PAGE银染

质谱鉴定报告

原始数据以及完整性实验报告

五.结果实例