靶向S蛋白CAR-T细胞来源的纳米囊泡在COVID-19治疗中的应用

【研究背景】

在针对COVID-19的众多治疗方法中，针对SARS-CoV-2的中和抗体和瑞德西韦（remdesivir）被认为是治疗COVID-19极具前景的两种药物。然而，虽然两种方法在COVID-19患者的治疗中已经取得了一定疗效，但是仍存在一些问题有待解决。在中和抗体治疗COVID-19方面，目前备受关注的两个问题是病毒对抗体产生的耐药性和潜在的抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement，ADE）效应；而以remdesivir为代表的小分子药物由于存在一定的毒副作用，患者的收益仍有限。

【成果介绍】

为此，中山大学附属第五医院黄曦教授团队通过将两种靶向新冠病毒S蛋白的中和抗体的单链可变片段（single-chain variablefragment,  scFv）以双特异性嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）蛋白的方式表达在纳米囊泡表面，构建一种同时具有中和病毒和靶向递送药物能力的纳米囊泡平台技术，从而解决中和抗体和remdesivir治疗COVID-19时遇到的难题。

首先，该团队成功制备了CR3022 CAR-T、B38 CAR-T和CR3022/B38 CAR-T细胞，并使用这三种CAR-T细胞成功制备了相应的纳米囊泡，这些纳米囊泡粒径均一、形态良好且均有CAR蛋白的表达。（图1-2）

接着，该团队验证了三种CAR-T细胞来源的纳米囊泡对新冠S蛋白具有良好的靶向性，这为药物靶向递送奠定了基础。（图3）

紧接着，利用中和实验验证了三种CAR-T细胞来源的纳米囊泡对S蛋白假病毒均具有良好的中和能力。其中，CR3022/B38 NVs比CR3022 NVs和B38 NVs具有更强的中和能力，说明两种scFv的共表达具有功能叠加效应。此外，尽管S蛋白中的N439K突变大幅降低了B38 NVs的中和能力，但仅轻度降低了CR3022/B38 NVs的中和能力，说明两种scFv的共表达可减少因S蛋白突变而造成的病毒逃逸。（图4）

然后，通过电穿孔技术，纳米囊泡对remdesivir的装载效率达到了20%左右。而且，CR3022/B38 NVs能有效地将remdesivir靶向递送到293T-S细胞上。（图5）

最后，体内实验表明，从尾静脉注射的CR3022/B38 NVs能有效聚集在LLC-S肿瘤组织中。此外，CR3022/B38 NVs能有效地阻断S蛋白假病毒感染LLC-ACE2肿瘤组织。这些结果表明，CR3022/B38 NVs在体内也具有良好的靶向性和中和能力。（图6）

原理图. 靶向S蛋白CAR-T细胞来源的纳米囊泡的制备方法和治疗原理

图 1. 三种CAR-T 细胞的制备和表征。a)CR3022 CAR、B38 CAR和CR3022/B38 CAR的分子设计。b) 通过荧光显微镜观察慢病毒转染T 细胞的效率。c) 使用蛋白质 L 检测 T 细胞上CAR蛋白的表达。

图 2.三种 CAR-T 细胞来源的纳米囊泡的制备和表征。

a) TEM 检测三种纳米囊泡的形态和粒径。比例尺：100 nm。b) 通过 NTA 测定三种纳米囊泡的尺寸分布。c）通过蛋白质印迹分析的三种CAR-T细胞的纳米囊泡和全细胞裂解物中CAR蛋白的表达。 d) 流式细胞术分析纳米囊泡上 scFv 的表达。

图 3. 三种纳米囊泡在体外与S蛋白的特异性结合能力。 a）通过共聚焦验证纳米囊泡的靶向性； b）通过流式细胞术验证纳米囊泡的靶向性

图 4. 三种纳米囊泡有效中和了S蛋白假病毒。a) 在不同 MOI 下使用S蛋白假病毒感染293T 和293T-ACE2细胞。 b-e) 不同纳米囊泡（外泌体）中和S蛋白时的IC50。

图 5. CR3022/B38 NVs 向293T-S 细胞递送瑞德西韦的效率。a) 使用分光光度计确定瑞德西韦的标准曲线。b) 使用不同方法将瑞德西韦载入纳米囊泡的装载效率。 c) 载有瑞德西韦的纳米囊泡在不同温度下的药物释放曲线。 d) 残留在复融后纳米囊泡中的瑞德西韦。

 e) PBS、Free NVs、remdesivir、remdesivir-free NVs 和 remdesivir-CR3022/B38 NVs 分别与 293T 或 293T-S 细胞共同孵育，然后进行钙黄绿素-AM/PI 染色和荧光显微镜检测。

图 6. CR3022/B38 NVs 在体内的靶向性和中和能力。

a, b)  DiR 标记的Free NVs 和CR3022/B38 NVs在小鼠器官和肿瘤中的积累

c) 体内S蛋白假病毒中和试验的流程图。 d)注射S蛋白假病毒后，对小鼠进行 IVIS 成像。

总而言之，该团队证明CR3022/B38 NVs对S蛋白假病毒具有良好的中和能力，能够有效地减少因病毒突变发生的耐药；同时由于该囊泡不含有Fc段，有望规避ADE效应。此外，由于CR3022/B38 NVs具有良好的药物装载能力和靶向性，可以有效地将抗病毒药物递送到病毒感染的主要部位，从而减少药物的毒副作用，提高药物的疗效。装载remdesivir的CR3022/B38 NVs同时具备中和病毒和抑制病毒复制的能力，因此能更好地清除机体内的病毒。

中山大学博士生朱天川、肖雨晨、孟晓军为论文共同第一作者，黄曦教授（中山大学附属第五医院）、单鸿教授（中大五院）和刘磊教授（深圳第三人民医院）为该文章的共同通讯作者。

【作者简介】

黄曦，博士生导师、教授，主要研究领域：CAR-T细胞，IPS细胞和外泌体在肿瘤疾病中的应用。

【文章信息】

Zhu, T., Xiao, Y., Meng, X. et al. Nanovesiclesderived from bispecific CAR-T cells targeting the spike protein of SARS-CoV-2for treating COVID-19. J Nanobiotechnol 19, 391(2021). https://doi.org/10.1186/s12951-021-01148-0

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