细胞培养和辐照处理

人肺腺癌细胞系A549和PC9获自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。将细胞置于 T-75 烧瓶中，并在含 10% 胎牛血清（CELLIGENT，新西兰）的 RPMI-1640 基础培养基（BASALMEDIA，中国）中，在 5% CO2 和 37°C 的培养箱中培养。在昆明医科大学第三附属医院放射治疗中心，使用RS2000生物X射线生物辐照仪（美国乔治亚州），在室温下以280 keV的能量、1.8 Gy/min的剂量率对细胞进行辐照。为了建立抗放疗细胞系，A549 和 PC9 细胞重复接受 4 Gy X 射线照射，总剂量为 56Gy。两个子汇合处 75-cm 2将细胞烧瓶重复暴露于 4 Gy X 射线照射。第一次照射时烧瓶中存在的细胞总数约为 1 × 10 7。允许间隔3至5天暴露已生长至80%密度的受辐射细胞，以便细胞能够存活。通过这种方式，每次照射时存在的细胞数量大致保持恒定。每次照射时添加新鲜培养基，每五个部分后，合并两个烧瓶的内容物，并将一小部分分别铺板。这些细胞用于克隆形成测定并建立冷冻储备。通过持续低剂量照射而获得放射治疗抗性的细胞系分别命名为A549IR和PC9IR。

实时定量 PCR (qRT-PCR)

通过TRIzol从每个烧瓶中的细胞系中提取总 RNA ，并使用 SYBR Green Master Mix 试剂盒将其逆转录为 cDNA。β-肌动蛋白基因用作内源对照。引物序列如下：AURKA，正向5-GGTCAGTACATGCTCCATCTT CCAG-3'，反向5'-AGAACTCCAAGGCTCCAGAGATCC-3'；NAPSA，正向 5' -CTTCAGTGTGCCCTGCTGGTTAC-3'，反向 5' - CATCTACCCGCCCAGTTCCATATTG-3'；和SHC1，正向5'-TGAGGGTGTGGTTCGGACTAAGG-3'，反向5'-CCGCAGA GATGATGGGCAAGTG-3'。使用比较Ct方法(2- △△Ct )分析数据。

蛋白质印迹分析

用冰冷的PBS洗涤细胞培养瓶，然后加入冰冷的裂解缓冲液（Solarbio，中国）。以 12,500 rpm 和 4°C 收集细胞裂解物，并在上样缓冲液中煮沸 10 分钟。蛋白质在 12.5% SDS-PAGE 凝胶上解析，转移到 PVDF (0.2 µm) 膜上，并用 5% 脱脂奶粉封闭。使用以下一抗：LC3B (#43566, CST) 为 1:1000，SQSTM1/p62 (#8025, CST) 为 1:1000，GAPDH (#5174, CST) 为 1:5000。按照制造商的说明稀释 LC3b 和 p62 的一抗，并在 4°C 摇床上低速孵育过夜。然后，将二抗在摇床上低速室温孵育2小时。PVDF膜用PBS清洗3次，并使用ECL Plus试剂盒观察免疫反应过程。

集落形成测定

按照预实验在60mm培养皿中培养300个细胞，铺板后24h细胞完全贴壁后，弃去旧培养基，更换新鲜完全培养基，除去未贴壁的细胞。允许细胞在体外继续增殖六代以上。大约12-14天后，用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定，最后用结晶紫染色。计算具有> 50个细胞的克隆的数量。测量每个细胞系的铺板效率（PE），并使用方程SF=（形成的集落数）/（接种的细胞数×假辐射组的铺板效率）×100%计算存活分数。

结果

LUAD放疗中涉及的关键基因的鉴定

为了确定与放疗相关的基因，我们进行了 WGCNA。样本聚类结果显示没有异常样本，最佳软阈值为3，其中R 2约为0.85。合并相似模块后，我们最终确定了 11 个模块，brown4 模块与放射治疗最相关（cor = -0.3，p 值 < 0.01）。因此，brown4 模块中的 1,900 个基因被用于下游分析。

LUAD 中 DERRAG 的鉴定

RS 组和 RR 组之间共鉴定出 1121 个 DEG。前 100 个 DEG 的表达式显示在热图中（。将 1121 个 DEG 与 1900 个模块基因和 1183 个 ATG 相交后，AURKA、CTSV、DAPK1、FGFR3、NAPSA、PLCH1、RGL1、SESN3、SHC1、SLC7A5和SMPD1被识别为 LUAD 中的 DERRAG。DERRAGs显着富集13种细胞成分，包括板层体、溶酶体腔、液泡腔、减数分裂纺锤体、TORC2复合体、原核、GATOR2复合体、纺锤体极中心体、TOR复合体、Seh1相关复合体、生殖细胞核、内溶酶体和微绒毛膜以及溶酶体、Ras 信号传导和膀胱癌的通路

自噬相关风险评分模型的构建和验证

我们研究了 DERRAG 的预后价值。通过单变量 Cox 回归分析，NAPSA、SHC1、AURKA、CTSV和SLC7A5与 LUAD 的 OS 密切相关。然后，将5个基因输入多元Cox回归，进一步选择SHC1、NAPSA和AURKA建立自噬相关风险模型。根据SHC1、NAPSA、AURKA的系数和表达量计算风险评分，将病例分为两个风险组。高危组中SHC1和AURKA的表达显着升高，而NAPSA的表达较低。此外，两个风险组之间的生存率也存在显着差异。通过ROC曲线考察风险模型的预测效率，风险模型显示出中等准确度，曲线下面积（AUC）> 0.6。在内部TCGA中也获得了一致的结果和外部GSE50081数据集

LUAD建立自噬相关列线图

接下来，通过单变量分析研究独立预后因素。我们发现风险评分、肿瘤疾病阶段、患者吸烟史类别、诊断年龄和性别与预后显着相关。然后对这些因素进行多变量分析，风险评分和肿瘤疾病分期仍然与预后显着相关，表明它们是 LUAD 的独立预后因素。此外，我们使用风险评分和肿瘤疾病阶段构建列线图来预测生存率。校准曲线显示预测的 1 年和 3 年 OS 接近实际观察到的 OS

风险评分与细胞增殖密切相关

为了阐明 LUAD 中这些预后特征的相关途径，进行了 GSEA 分析。高危组基因富集于与细胞增殖相关的生物过程，包括细胞周期G2/M期转变、DNA构象改变、染色质组装或分解、DNA依赖性DNA复制、染色体分离、DNA包装、DNA复制、减数分裂 I 细胞周期过程、双链断裂修复和减数分裂细胞周期。与 GO 结果一致，当应用 KEGG 时，高危组中细胞增殖相关通路也得到富集

低危组和高危组的免疫微环境不同

考虑到免疫微环境在 LUAD 进展中的重要性，我们检查了两个风险组患者的免疫浸润状况。我们观察到CD8 T细胞与细胞毒性细胞、iDC与DC、巨噬细胞与DC、巨噬细胞与iDC、NK CD56dim细胞与细胞毒性细胞、T细胞与B细胞、T细胞与细胞毒性细胞、Th1细胞之间存在中度或强相关性。 LUAD 中的细胞毒性细胞、Th1 细胞和 DC、Th1 细胞和巨噬细胞、Th1 细胞和 T 细胞、Treg 和 T 细胞、Treg 和 Th1 细胞。此外，aDC、巨噬细胞、B 细胞、NK CD56dim 细胞、DC、Tcm、iDC、Treg、T 细胞、中性粒细胞、Th1 细胞和 Th2 细胞的浸润在两个风险组中显着不同。AURKA 表达与 Th2 细胞丰度呈显着正相关，NAPSA表达与Th2细胞和DC浸润呈显着正相关或负相关。尽管SHC1表达与多个差异浸润的免疫细胞具有显着的正相关或负相关，但它们的相关性非常弱(|cor| < 0.3

通过构建与原代细胞相比的耐药细胞系来验证 SHC1、NAPSA 和 AURKA 基因、放疗敏感性和自噬之间的关系

通过细胞的间隔照射构建抗辐射细胞。在本研究中，我们发现抗辐射细胞系在克隆形成实验中对辐射有抵抗力，其IR后的细胞存活率明显高于原代细胞的存活率。

通过蛋白质印迹分析发现抗辐射细胞的自噬水平升高。通过 qRT-PCR 验证，放射抗性细胞中 RRAG（SHC1、AURKA）的表达高于原代细胞。然而，在放射抗性细胞和原代细胞之间未观察到NAPSA基因表达的显着差异。NAPSA基因主要在LUAD和肾癌中高表达；因此，NAPSA基因可能与组织分型密切相关。我们用于构建抗辐射细胞的原代细胞均为LUAD细胞；因此，放射抗性细胞和原代细胞之间的NAPSA基因表达没有显着差异。