Day9——PHB2通过抑制PKM2剪接维持VSMCs的收缩表型
去年10.28的文章，关注VSMC的表型转换
作者关注到的现象：VSMC的表型转换过程中，线粒体氧化磷酸化会逐渐变为有氧糖酵解。
然而，VSMC调节这二者之间平衡以维持收缩表型的内源性调节剂仍不清楚。
PHB2是参与多种细胞功能的多效支架蛋白，广泛表达在核、质、线粒体中。
Result1：rna序列分析预测将能量稳态与VSMCs收缩表型联系起来的新的候选基因
VSMC的两种表型：收缩型和分泌型。TGF-B能使VSMC向收缩型转换，PDGF使其向分泌型转换。因此用TGF和PDGF分别处理VSMC，前者上调而后者下调的基因是维持收缩表型的基因。有6个。其中变化最明显的是PHB2。
siRNA敲低PHB2，观察到VSMC收缩表型标志基因下调。进一步提示PHB2可能参与收缩表型的维持。
PHB2定位于中膜层 /////怎么看出来的？
Result2：PHB2减少与VSMCs转分化相关
用WB进一步验证。此外使用血清饥饿条件诱导收缩表型，PHB2表达上升。
大鼠颈动脉球囊损伤后3、7和14天，PHB2的表达明显降低，VSMCs收缩标记物减少，新生内膜面积增加。颈动脉内膜切除术患者的动脉中PHB2的表达较对照组乳腺内动脉明显降低。
前两个results好奇怪qwq，第一个体外测mRNA，第二个测蛋白+血清模型+体内，另外做了随时间表达。难道是简单筛选——进一步验证？
Result3：PHB2在体外维持VSMC的收缩表型
siRNA敲低PHB2，收缩标志基因表达下调。并且可以逆转TGF-B造成的向收缩表型转变。
敲除PHB2，收缩基因表达下调。
VSMC从细长形的收缩态转变为多边形的分泌态
一些评估收缩性的指标（凝胶收缩实验、对苯肾上腺素的反应性）
一些评估迁移能力的指标（划痕实验、Boyden实验）
偏个题介绍一下Boyden实验。感觉就是transwell
上层细胞在下层趋化试剂的作用下迁移下去
这一部分，还是在验证PHB2对维持VSMC收缩表型很重要
Result4：在体内PHB2缺乏可加速损伤后新生内膜形成
VSMC特异性敲除PHB2的小鼠，收缩表型的标志减少
而细胞增殖活性增加（BrdU评估细胞增殖）
新生内膜面积增加
这一部分就是在体内的验证
Result5：hnRNPA1是PHB2的新型结合蛋白
在大鼠原代VSMC中探索PHB2的结合蛋白。用PHB2抗体处理，做液相色谱分析，由此检测出了一些结合蛋白。其中hnRNPA1排第一
hnRNPA1是一种在多种生物过程中具有重要作用的蛋白。一项近期研究表明，hnRNPA1在损伤后内膜生成中调节VSMC增殖和代谢中具有重要作用。
要验证两种蛋白之间具有相互作用——先看看是否调节其基因表达——敲低一个，看看另一个的表达量是否变化——然后看二者是否直接结合——IP——分区域IP
在核、质中分别进行IP，在核中结合，而在质中不结合
表达出各种突变体，得到了二者的结合域
结论：PHB2的C端与hnRNPA1的RGG-box结构域结合
Result6：hnRNPA1-PHB2相互作用在体内和体外对于维持VSMC收缩表型是必要的
单克隆hnRNPA1的RGG域和M9C端。M9能使hnRNPA1出核，以此阻断核内hnRNPA1与PHB2的结合。
这样做的结果是抑制了收缩基因的转录、细胞迁移性增加
体内实验：球囊损伤后第七天，收缩基因表达增加
内膜增厚
这部分说明了PHB2与hnRNPA1结合的重要性
但要是没有M9怎么办呢
Result7：PHB2抑制hnRNPA1介导的prePKM mRNA剪接、PKM2表达和有氧糖酵解
hnRNPA1是已知的prePKM mRNA的调节蛋白，PKM2是糖酵解的最终限速步，PKM1促进氧化磷酸化，二者来源于mRNA的不同剪接。PKM2表达增加可促进动脉粥样硬化，而缺失PKM2能抑制损伤后内膜生成。因此这部分研究了PHB2是否影响hnRNPA1介导的mRNA剪接，以及所造成的PKM表达量改变、代谢改变。
用PstI和NcoI酶切扩增子后进一步进行RTPCR，结果显示Phb2缺乏促进了PKM1向PKM2的反式表达
敲除PHB2也能促进PKM1向PKM2转化
抑制结合之后也是
糖酵解增强，氧化磷酸化降低
PDGF刺激的VSMC中，PHB2抑制的转分化被过表达PKM2消除
VSMC特异性PKM2敲低能够抑制新生内膜形成
总结一下：在正常的VSMC中，PHB2结合hnRNPA1，抑制hnRNPA对pre-PKM mRNA的剪接，此时生成PKM1，促进氧化磷酸化，维持VSMC收缩表型。病理条件下hnRNPA1剪接pre-PKM mRNA，生成PKM2，促进糖酵解，使VSMC转化为分泌型。
Discussion
PHB2能调节代谢重编程
PHB2不调节hnRNPA1的表达水平
mi-124？
磨磨蹭蹭终于读完了
