软琼脂克隆形成实验

软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验(Anehorage-independentassay）。利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。软琼脂克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。

操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%琼脂（Agarose 加蒸馏水配置），高压灭菌后4摄氏度冰箱保存。铺板当天微波炉或烘箱加热融化，置于37摄氏度培养箱中。

2.铺下层胶：按1：1比例混匀1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2mL混合液，在室温条件下等待冷却凝固。

3.取对数生长期细胞，消化配置成单细胞悬液，计数后将细胞数调整为5*10^4/mL。

4.铺上层胶：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培养基混匀，取2mL混合液于EP管中，向管中加入10-20微升细胞悬液，充分混匀后加入已铺下层胶的6孔板中，待上层琼脂凝固后，放在37摄氏度培养箱中培养2-3周，每三天向孔板中加入200微升培养基。

5.显微镜下拍照，统计克隆直径并作图。

以下述为例：

116-con：1.2*10^6

116-OE：1.1*10^6

将细胞配置成5*10^4/mL

116-con：42+958培养基

116-OE：45+955培养基

注意事项

1.细胞一定要吹打分散成单细胞悬液

2.接种时细胞密度不可过高

3.软琼脂与细胞混合时温度不可超过40摄氏度，容易烫伤甚至烫死细胞。

4.软琼脂对热和酸不稳定，反复加热容易降解并产生毒性，且容易造成硬度下降，因此需要高压灭菌后进行分装。

5.铺板操作时速度要快，以免造成局部凝固。

耗材：