m7G相关LncRNA特征的鉴定预测肝细胞癌的预后及实验验证

2023-01-29 15:35 作者:275276 0人读过 | 我要投稿

Identification of a Novel N7-Methylguanosine-Related LncRNA Signature Predicts the Prognosis of Hepatocellular Carcinoma and Experiment Verification

结果

HCC 中差异表达的 m7G 相关基因

我们根据 TCGA-LIHC 中的表达数据（371 个 HCC 样本和 50 个正常样本）对 29 个 m7G 相关基因进行了差异表达分析。差异表达模式呈现为热图。具体而言，NUDT11 表达水平显着更高，而 NUDT10 在肿瘤组织中的表达水平显着降低。此外，相关性分析显示 29 个 m7G 相关基因之间存在内在关联

m7G相关基因在HCC中的表达模式。( a ) 热图可视化每个样本中 m7G 相关基因的表达水平。绿色代表低表达，红色代表高表达。( b ) vioplot 显示了 HCC 中差异的 m7G 相关基因。蓝色代表正常样本，红色代表 HCC 样本。白点代表表达的中值。( c ) HCC中29个m7G相关基因的Spearman相关性分析。HCC，肝细胞癌；m7G，N7-甲基鸟苷；N，正常样本；T，肿瘤样本。** p < 0.01；*** p < 0.001。

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m7G 相关 LncRNA 预测特征的鉴定

首先，我们使用 Spearman 相关分析（|r系数| > 0.3 和p < 0.001）通过 m7G 相关 mRNA 和 lncRNA 的共表达筛选了 539 个 m7G 相关 lncRNA 。然后，使用单变量 Cox 回归将总共 84 个 lncRNA 鉴定为预后因素。对这些具有预后意义的 lncRNA 进行套索回归分析以避免可能的过度拟合并提高预测准确性，然后进行多变量 Cox 回归。最后，我们筛选了七个有意义的 m7G 相关 lncRNA 用于预测特征（表格1,补充图 S1 )。包含 m7G 相关 lncRNAs-mRNAs 的共表达网络在图 3光盘。每个患者的 m7GRLsig 评分计算为流动方程：风险评分 = (0.18133 × ZFPM2-AS1) + (0.36071 × AC092171.2) + (0.34046 × PIK3CD-AS2) − (0.42774 × HPN-AS1) -( 0.41772 × AC022613.1) + (0.48860 × NRAV) + (0.34254 × CASC19)。

筛选出在 HCC 中具有显着预后价值的 m7G 相关 lncRNA。( a ) 使用 10 倍交叉验证的 LASSO Cox 回归用于确定选择独立因素的最佳因素。垂直虚线表示最佳参数 (lambda) 值。（b）套索系数的配置文件。( c ) 预后 m7G 相关 lncRNAs-mRNAs 的共表达网络。( d ) 预后 m7G 相关 lncRNA、mRNA 和风险类型之间关系的 Sankey 图。HCC，肝细胞癌；m7G，N7-甲基鸟苷；lncRNA，长链非编码RNA；LASSO，最小绝对收缩和选择算子。

m7GRLSig 的预后影响

HCC 患者随后根据中位风险评分作为截止值分为低风险和高风险组，并随机分配到两个内部验证组。Kaplan-Meier 分析显示，在两个内部集合中，高风险组的 OS 均短于低风险组（所有p < 0.001）。整个集合产生了相似的结果 ( p < 0.001)。第一个内部组的 1 年、3 年和 5 年生存曲线下面积 (AUC) 值分别为 0.841、0.739 和 0.763。第二个内部组的 1 年、3 年和 5 年生存率的 AUC 值分别为 0.695、0.680 和 0.748. 整个集合也显示了该模型的良好预测能力。风险曲线和散点图表明生存状态取决于新开发的签名。热图显示了七种 lncRNA 在高危组和低危组之间的不同表达模式（图 5e,f,补充图 S2e )。此外，我们发现高危组和低危组在 T 分期、分期、分级和 fustat 方面存在差异（p < 0.05）我们评估了具有不同临床病理特征的亚组中的 OS。我们发现 m7GRLsig 在按男性患者（）和年龄、T 分期（T1 和 T2-4）、分期

图 4
m7G相关lncRNAs预后特征预测能力的验证。( a , b )低风险组和高风险组之间的第一个内部集 ( a )、第二个内部集 ( b )中 HCC 的 OS 曲线的 Kaplan-Meier 生存分析。( c , d ) 第一个内部组 ( c ) 和第二个内部组 ( d )中 m7G 相关 lncRNA 风险评分的 ROC 分析。HCC，肝细胞癌；m7G，N7-甲基鸟苷；lncRNA，长链非编码RNA；OS，总生存期。

图 5
M7G 相关 lncRNA 签名风险评分分析。( a , b ) 第一个内部集合 ( a ) 和第二个内部集合 ( b ) 中低风险和高风险组的风险评分分布。( c , d ) 第一个内部集合 ( c ) 和第二个内部集合 ( d )中具有不同风险评分的患者的生存时间。绿色和橙色的点分别代表生存和死亡。( e , f ) 热图显示了 m7G 相关 lncRNA 的表达水平，第一个内部集合 ( e ) 和第二个内部集合 ( f )) 在低风险和高风险人群之间。m7G，N7-甲基鸟苷；lncRNA，长链非编码RNA。

图 6
高风险和低风险人群中 7 个预后 m7G 相关 lncRNA 和临床病理特征分布的热图。m7G，N7-甲基鸟苷；lncRNA，长链非编码RNA；T，肿瘤大小；N，淋巴结转移；M，远处转移。*, p < 0.05; ***，p < 0.001。

m7GRLSig 的独立预后分析

单变量 Cox 回归分析显示风险评分与 HCC 患者的 OS 显着相关。多元回归分析进一步表明，风险评分可以作为 HCC 患者的独立预后指标). 风险评分的AUC值优于临床特征对HCC预后的预测准确性，表明 M7RLSig 对 HCC 预后的风险模型被认为是可靠的。此外，我们建立了列线图来预测 1、3 和 5 年的 HCC 预后。校准曲线显示列线图具有良好的预测能力

HCC 风险模型评分的单变量和多变量 Cox 回归分析。对风险评分和临床特征进行单变量 ( a ) 和多变量 ( b ) Cox 森林图。( c ) 风险评分和临床因素的 AUC 以及 ROC 曲线。HCC，肝细胞癌；T，肿瘤大小；N，淋巴结转移；M，远处转移。

图 8
用于生存预测的临床预后列线图。( a ) 风险评分和临床因素的列线图预测 HCC 患者 1 年、3 年和 5 年的 OS。1 年 ( b )、3 年 ( c ) 和 5 年 ( d ) OS 校准曲线评估了预测 OS 与实际 OS 之间的一致性。OS，总生存期；HCC，肝细胞癌。

通过 m7GRLSig 分层的差异 m7G 修改状态

基于全基因组、m7G 相关基因、m7G 相关 lncRNA 和 m7GRLSig 模型进行 PCA 分析，以进一步评估 m7GRLSig。全基因组表达、m7G相关基因, 和 m7G 相关的 lncRNAs 不能有效区分低危和高危患者；然而，m7GRLSig 模型的条款可以有效地区分这两组, 揭示了低风险组和高风险组之间不同的 m7G 修饰状态。m7GRLSig 的判别力进一步证明了该模型具有可靠的聚类能力。使用 GSEA 鉴定了与 m7GRLSig 相关的差异生物学途径。我们发现细胞周期、嘌呤和嘧啶代谢途径在高危人群中得到了丰富. 此外，核苷/核糖核苷三磷酸的代谢和生物合成过程、翻译调节活性和核酸结合在具有高风险评分的 HCC 患者中显着丰富。功能注释进一步证实m7GRLSig模型可能与核酸代谢和基因修饰有关。

高危人群和低危人群m7G修饰状态的差异分析。基于全基因组 ( a )、m7G 相关基因 ( b )、m7G 相关 lcnRNAs ( c ) 和 m7GRLSig ( d ) 模型的低风险和高风险人群之间的主成分分析 (PCA )。高风险人群用红色表示，低风险人群用绿色表示。( e , f ) 基于 m7GRLSig 的 lncRNA 的 GSEA。KEGG 确定 HCC 中高风险和低风险相关的信号通路 ( e )；GSEA GO 识别 HCC 中高风险和低风险相关的信号通路（f). GSEA，基因集富集分析；KEGG，京都基因和基因组百科全书；GO，基因本体；HCC，肝细胞癌；m7G，N7-甲基鸟苷。

免疫景观与 m7GRLSig 之间的相关性

我们调查了 m7GRLSig 是否与 HCC 的免疫环境相关。实施CIBERSORT算法来比较两个风险组之间免疫细胞的浸润比例。在高风险组中观察到更高比例的 M0 和 M2 巨噬细胞。相比之下，单核细胞、CD8+ T 细胞和活化的 NK 细胞主要浸润低危组。大多数免疫检查点基因（PDCD1、CD48、BTNL2、CD276等）在高危人群中显着上调基于 m7GRLSig 模型对单样本基因集富集分析 (ssGSEA) 进行量化，以探索免疫细胞浸润分数和功能。免疫细胞评分分析显示，aDCs、DCs、iDCs、巨噬细胞、肥大细胞、Tfh 细胞、Th1/2 细胞和 Tregs 的浸润分数在两组之间存在显着差异。APC 共刺激、CCR、检查点、HLA、MHC I 类、副炎症和 T 细胞共刺激的免疫功能在高风险组中被上调，而 II 型 IFN 反应在低风险组中被上调(图 10d). 这些结果阐明了 m7GRLSig 在 HCC 免疫景观中的作用。

低风险和高风险人群之间的差异免疫景观。( a ) 高危组与低危组肿瘤免疫细胞浸润比较。( b ) 31个检查点在高危组和低危组的表达差异。高危组和低危组免疫细胞（ c）和免疫功能（d ）的ssGSEA评分比较。ssGSEA，单样本基因集富集分析。ns，无意义；*, p < 0.05; **，p < 0.01；***，p < 0.001。

药物治疗与 m7GRLSig 之间的相关性

我们进一步探讨了 m7GRLSig 风险评分与药物治疗 HCC 疗效之间的相关性。阿西替尼、拉帕替尼、吉非替尼和厄洛替尼对低 m7GRLSig 评分的患者更敏感（图 11a–d)，而顺铂、博来霉素、依托泊苷和丝裂霉素对 m7GRLSig 评分较高的患者更敏感（图 11e-h）。药物-m7GRLSig 相关性分析表明，m7GRLSig 评分与对药物的敏感性相关，表明 m7GRLSig 是 HCC 临床治疗的潜在预测因子。

高危组和低危组之间治疗药物敏感性的比较。阿昔替尼 ( a )、拉帕替尼 ( b )、吉非替尼 ( c )、厄洛替尼 ( d )、顺铂 ( e )、博莱霉素 ( f )、依托泊苷 ( g ) 和丝裂霉素 ( h )的 IC50 值。

敲低 NRAV 抑制 HCC 增殖和转移并影响 METTL1 表达

如上所述，PIK3CD-AS2、AC092171.2、NRAV、ZFPM2-AS1 和 CASC19 是 m7GRLSig 模型中的危险因素；AC092171.2、NRAV 和 ZFPM2-AS1 的表达在 TCGA 队列的肿瘤组织中显着更高（补充图 S4a-e）。qRT-PCR 分析显示，与 L02 细胞相比，HCC 细胞系中 AC092171.2、NRAV 和 ZFPM2-AS1 的表达更高（图 12a-c). 如图所示图 2c，这些 m7G 相关基因中的大多数与 NRAV 显着相关，包括 METTL1，据报道 METTL1 通过 m7G 修饰作为最关键的调节因子促进 HCC 进展。因此，我们评估了 HCC 进展过程中 NRAV 和 METTL1 之间的关联。与阴性对照相比，用 si-NRAV 处理的细胞中 NRAV mRNA 水平显着降低（图 12d). Transwell 实验表明，与阴性对照相比，si-NRAV 预处理的细胞中 Huh7 和 HepG2 细胞的迁移和侵袭能力受到抑制（图 12e,f). 此外，与阴性对照相比，NRAV 的敲低显着降低了 Huh7 和 HepG2 细胞的增殖（图 12g-i）。鉴于 NRAV 和 METTL1 之间存在很强的正相关性（图 12j)，我们推测 NRAV 也可能在 HCC 进展过程中调节 METTL1 的表达。METTL1 的 mRNA 表达在 si-NRAV 预处理的 Huh7 和 HepG2 细胞中显着下调（图 12k,l）。NRAV 可能通过影响体外 METTL1 表达来正向调节 HCC 进展。这些结果表明，m7GRLSig 中的预后 lncRNA 可能通过靶向 m7G 调节剂来调节 HCC 进展过程中的 m7G 修饰。

敲低 NRAV 可抑制 HCC 的增殖和转移，并影响 mettl1 的表达。对 HCC 细胞和正常 L02 细胞进行 qRT-qPCR 以验证 AC092171.2 ( a )、NRAV ( b ) 和 ZFPM2-AS1 ( c ) 的表达。用 si-NRAV 或 si-NC 转染的 Huh7 和 HepG2 细胞中 NRAV 的 mRNA 表达 ( d )。Transwell 测定显示转染 si-NRAV 或 si-NC的 Huh7 ( e ) 和 HepG2 ( f ) 细胞的迁移和侵袭。用 si-NRAV 或 si-NC 转染的 Huh7 和 HepG2 细胞的CCK-8（g，h）和菌落测定（i ）。( j) TCGA-LIHC 数据库中 NRAV 和 METTL1 的相关性。NRAV mRNA 在用 si-NRAV 或 si-NC 转染的 Huh7 ( k ) 和 HepG2 ( l ) 细胞中的表达。HCC，肝细胞癌；NC，阴性对照；TCGA-LIHC，癌症基因组图谱-肝细胞癌。**，p < 0.01；***，p < 0.001；****，p < 0.0001。

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