「青莲聚焦」药物作用机制的蛋白质组全图谱

2023-03-08 11:03 作者:青莲百奥 0人读过 | 我要投稿

研究背景

小分子调节剂通过多种机制影响其靶蛋白，对这些生物活性分子的作用机制（MOA）进行研究可以带来更好的干预治疗。2023年1月3日，哈佛大学医学院Steven P. Gygi团队在Nature Biotechnology（影响因子68.164）上发表了文章A proteome-wide atlas of drug mechanism of action，描述了875种小分子扰动剂的全蛋白质组图谱，并整合数据揭示了蛋白质组中对化学扰动剂最敏感的部分，揭示了配体诱导的蛋白质表达变化和化合物调节其蛋白质靶标的规则。使用蛋白质-蛋白质和化合物-化合物相关网络来揭示了几种化合物的作用机制。

研究思路

作者基于96孔板的高通量药靶筛选方法，结合定量蛋白质组学在人类癌细胞系HCT116中分析了 875 种化合物，细胞与筛选化合物(10µM)、二甲基亚砜(DMSO)或阳性对照化合物一起孵育24h，然后进行裂解、胰蛋白酶消化，使用TMT11-plex标记试剂进行标记检测。

结果展示

一、基于药物机制的综合蛋白质组分析

在每种化合物影响的细胞中平均量化了8863种蛋白质，实现了深度蛋白质组覆盖。对照化合物的生物重复Pearson 相关性(r)中位数为0.87，在对两次重复进行平均后没有明显的异常值，这些结果突出了这些测量的可重复性。对于免疫调节药物(IMiD)泊马度胺，观察到了其已知作用机制的直接证据，通过与CRBN21形成三元复合物来降解多种蛋白质。虽然介导IMiD在多发性骨髓瘤中的治疗作用的转录因子IKZF1和IKZF3未在HCT116细胞中表达，但其他几种已知的新底物，包括几种转录因子被下调，重复之间的差异很小（图1d）。

二、蛋白质组由小分子动态调节

这些扰动剂引起的靶标丰度变化因蛋白质而异。由两个标准定义蛋白质发生的调控事件：(1)与DMSO相比的两倍变化或 (2) 蛋白质表达相对于所有化合物中该蛋白质的平均变化的五个标准差变化。在此，确定了对扰动剂治疗有异常频率反应的蛋白质只在一个方向上发生变化（图2c）。上调的蛋白质富含类固醇生物合成、线粒体自噬和铁死亡途径的成员，表明HCT116细胞通过自噬和甾醇代谢的上调来克服外源性应激源。下调的蛋白质富含来自几种细胞周期相关途径的蛋白质，包括p53信号转导，表明这些细胞通常通过细胞周期停滞对扰动剂诱导的应激做出反应（图2d）。根据每个调控的蛋白质数量对化合物进行排名，发现最活跃的化合物调节高达25%的可观察蛋白质组，其中蛋白酶体抑制剂主要诱导蛋白质上调，而转录抑制剂诱导蛋白质下调。

三、靶蛋白的调控为化合物 MOA提供信息

分析研究结果，发现了875种化合物中近50%注释主要靶标，大多靶蛋白在含有目标化合物的11-plex中定量（图3a），15%的化合物调节其靶蛋白的表达（图3b），上调比下调更频繁。在高活性化合物中，这些高活性化合物除了调控其靶标外，还调控许多其他蛋白质。许多调控事件是扰动重要细胞过程的间接后果，例如基于nutin的MDM2抑制剂对其靶标的调节水平几乎相同，这表明了机制特异性的调节阈值（图3c）。

TNKS1/2抑制剂这两种相关的ADP核糖基酶影响包括WNT信号传导在内的多种途径。这些蛋白质也被蛋白酶体和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂以及PARP抑制剂他拉唑帕尼上调（图 3f）。血管动蛋白家族蛋白（AMOT、AMOTL1和AMOTL2）受TNKS通过直接相互作用和信号TNKS抑制调节，在用三种TNKS抑制剂和他拉唑帕尼处理的细胞中显示表达增加，但在奥拉帕尼处理时没有。这些发现表明，在10μM时，他拉唑帕尼（而非奥拉帕尼）对TNKS/TNKS2具有脱靶活性。最后，注意到双特异性激酶CLK1的频繁上调（图2c）。整个CLK激酶家族通常在用激酶抑制剂处理的细胞中上调，CLK1和CLK4最容易上调。

四、MOA驱动着复合群落的形成

接下来使用整个蛋白质组指纹数据库通过关联所有可能的化合物对的蛋白质组文件来生成MOA相似性网络。形成了一个化合物-化合物相关网络，其中包含382375个可能边中的2543个（图4a）。从这个网络中确定了相互关联的化合物群体，这些群体由具有重叠目标的化合物组成，其关联反映了共享生物学（图4b-h）。例如，一个化合物群体将MDM2和CDK4/6抑制剂归为一组（图4b），可能是因为这两类都会诱导G1停滞。

几种MAPK抑制剂形成了一个紧密的化合物群体，其中MEK抑制剂MEK162和RAF抑制剂AZ628在该组中相关性最高（图4f，g）。最后，观察到文库中的三种蛋白酶体抑制剂簇（图4h）；成对相关图表明这些抑制剂等效地抑制蛋白酶体降解（图4i）。这些发现支持复合MOA反卷积的复合-复合相关性的网络级分析。

五、蛋白质-蛋白质相关性揭示药物反应途径

接下来生成了一个蛋白质-蛋白质相关网络，最终网络（图 5a）包含2388个节点（所有量化蛋白质的24%）和35936条边。在这些群落中提取更强的蛋白质相关性揭示了包括着丝粒，其亚基NDC80-NUF2在数据集中具有最高的蛋白质水平相关性（图5b）。另一个化合物群体包括许多胆固醇生物合成蛋白以及几种高度相关的自噬蛋白，TMEM59表达与溶酶体蛋白LAPTM4A的表达密切相关，这些发现表明需要进一步研究LAPTM4A在自噬中的作用。最后，相关网络分析揭示了功能关联。作者还定义共同调节不同蛋白质群落的化合物家族。例如，几种 NDUF和琥珀酸脱氢酶 (SDHA)蛋白的相关调节由大约20种化合物驱动（图5e、f）。这些分析突出了该资源定义已知生物过程的新成员以及识别驱动感兴趣的途径和过程的药物和工具化合物的能力。

六、扰动剂诱导的蛋白质组指纹揭示药物机制

观察到SP2506、PAC-1和KH7三种没有已知重叠靶点的相关化合物。这三种化合物具有已知的可以螯合Fe(II)等金属阳离子的基序，相似的扰动剂的强烈相关的蛋白质组反应表明了一种由铁螯合驱动的共同机制，影响铁结合蛋白和酶的功能。还发现了尽管表面上靶向相同的蛋白质，但其蛋白质组水平效应不一致的化合物。由于HCT116细胞不表达BTK，依鲁替尼诱导的蛋白质组变化很少。然而，RN486引起了显著的蛋白质组重塑，表明非BTK脱靶。被RN486处理上调的蛋白质丰富了线粒体自噬、类固醇生物合成和细胞因子信号转导通路，而溶酶体在下调蛋白质中的比例过高。自噬标记物的上调加上溶酶体蛋白的减少表明自噬失调是RN486处理细胞的主要表型，这是许多激酶抑制剂的常见机制。使用与MS偶联的激酶亲和珠进行的实验未能发现RN486靶向的任何激酶，这表明非激酶脱靶介导了 RN486的作用。

七、JP1302抑制转录

为了测试该数据集对MOA反卷积的效用，鉴定了几种高活性化合物，其中包括JP1302，JP1302处理诱导了与几种RNA转录抑制剂相关的蛋白质组指纹（图6b）。这些相关化合物部分通过下调RNA聚合酶II (Pol II)磷酸化来抑制转录延伸。应用蛋白质-蛋白质相关性分析来进一步确定这组抑制剂的机制，发现了几种导致p53表达增加而MDM2/p21表达减少或保持不变的化合物（图 6c）。该分析进一步表明JP1302可能抑制RNA转录。比较了JP1302与THZ513诱导的蛋白质组变化。尽管这两种化合物同样下调了蛋白质表达（图6d），但几种下调的蛋白质是JP1302处理所独有的（图 6e）。其中三个，即组蛋白亚基H2AZ1、HP1BP3和H1FX，对药理学扰动有抵抗力（图6f）。

为了辨别JP1302如何下调蛋白质表达和降解组蛋白H1，再次使用细胞内PISA，并包括一个匹配的全蛋白质组实验。观察到用CDK9/12/13抑制剂黄酮吡啶治疗后没有效果，但JP1302和CBL0137都会改变许多RNA转录蛋白的热稳定性，其中FACT复合物亚基SUPT16H受影响最大（图6h）。这些发现表明JP1302可作为研究FACT复合物抑制和接头组蛋白降解的新化学工具。最后，作者通过评估几种浓度下的PolII磷酸化和p21表达来评估JP1302作为FACT复合物抑制剂的效力。检查了剂量依赖性蛋白质组重塑，发现随着JP1302浓度降低，处理后上调和下调的蛋白质的相对数量不同，表明通路激活存在浓度依赖性差异。

然后，将从每个浓度获得的蛋白质组指纹插入到化合物-化合物相关网络中（图6k）。用1µM JP1302处理的细胞与激活p53的基于nutlin的MDM2抑制剂最接近。p53敲除仅轻微影响JP1302抑制细胞增殖的能力，同时使MDM2抑制剂MI773几乎失活，证实了该化合物的p53独立机制。因此，JP1302动态影响细胞信号，DNA损伤在低浓度下驱动p53活性，而较高浓度导致FACT复合物破坏和RNA转录抑制。