靶向USP9x/SOX2轴有助于新藤黄酸的抗骨肉瘤作用

写在前面

        今天推荐的是由上海同仁医院虹桥国际医学研究院在2019年10月3日发表于Cancer Letters（2021IF：8.679，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Ying-Li Wu教授，研究表明靶向USP9x/SOX2轴有助于新藤黄酸的抗骨肉瘤作用。

研究背景

        SOX2（SRY-related HMG-Box Gene 2）是SoxB1亚家族转录因子之一，对胚胎干细胞的维持、多能性和自我更新至关重要。SOX2已被视为骨肉瘤中的关键癌蛋白。新出现的证据表明，诱导SOX2等转录因子的降解是使它们可成药的一种很有前景的策略。

摘要部分

        作者表明，新藤黄酸（NGA），一种大蒜的活性成分，在体外和体内通过泛素蛋白酶体介导的SOX2降解显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖。作者进一步确定USP9x是SOX2的一个去泛素酶，NGA在细胞中与USP9x直接相互作用。此外，敲低USP9x抑制了骨肉瘤细胞的增殖和集落形成，这可以通过SOX2的过表达得到回补。与此相一致的是，敲低USP9x可抑制骨肉瘤细胞在异种移植小鼠模型中的增殖。总之，作者确定USP9x是控制SOX2稳定性的一个去泛素化酶，而且USP9x是NGA的一个直接靶点。作者提出，针对USP9x/SOX2轴是治疗骨肉瘤和其他SOX2相关癌症的一种新策略。

研究内容

1.NGA抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡

        为了探索NGA对骨肉瘤的抗肿瘤作用，用NGA分别处理了骨肉瘤细胞系U2OS和143B。NGA明显抑制了肿瘤细胞的增殖。NGA处理导致U2OS和143B的caspase-3和PARP1以剂量和时间依赖的方式裂解，说明其诱导这两种细胞发生凋亡，由Annexin V/PI染色也显示NGA增加了凋亡细胞的百分比。此外，NGA有效地抑制了各种细胞中的集落形成。

研究结论：NGA可以抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡和集落形成。

2.SOX2的泛素化介导的降解促进了NGA的抗骨肉瘤作用     

        作者发现NGA可以以剂量和时间依赖性方式降低SOX2的蛋白质水平。而且蛋白酶体抑制剂 MG132 可以显着逆转NGA诱导的SOX2减少，说明SOX2的减少是蛋白酶依赖的。同时，NGA不会降低SOX2的 mRNA 水平但下调SOX2靶基因的表达。

        作者随后研究了NGA对SOX2泛素化状态的影响。作者发现NGA处理可以明显增加细胞中SOX2的泛素化，尤其是K48连接的泛素，这与蛋白酶体介导的蛋白质降解密切相关。为了测试SOX2是否有助于NGA的抗癌作用，SOX2在 U2OS 和 143B 细胞中过表达。结果表明，SOX2的过表达显着削弱了骨肉瘤细胞中NGA诱导的细胞死亡。

研究结论：SOX2的降解在NGA的抗骨肉瘤作用中起重要作用。

3.NGA抑制骨肉瘤生长并减少体内SOX2表达

        为了进一步证明NGA在体内的抗癌作用，作者使用了异种移植小鼠模型。与对照组相比，腹腔注射NGA显着降低了143B细胞形成的肿瘤的大小和重量。与体外NGA对SOX2的影响一致，NGA处理也降低了体内SOX2的表达。此外，尽管观察到体重略有下降，小鼠仍能耐受所用浓度的NGA。

研究结论：NGA在体内抑制骨肉瘤生长并降低SOX2表达。

4.USP9x维持SOX2的稳定性

        SOX2 泛素化的增加可能是由于 E3 泛素连接酶的激活或SOX2的DUB的失活。作者推测NGA可能抑制SOX2的DUB。作者首先进行了一次筛选，在HEK 293T细胞中过度表达了30个DUBs，并通过Western blot分析了它们对内源性SOX2蛋白水平的影响。作者发现，USP9x明显上调了SOX2的蛋白水平。似乎其他一些DUBs如USP7、USP2、USP14对SOX2也有影响。然而，除了WP1130（USP9x的抑制剂）之外，一些DUBs的市售抑制剂对SOX2的表达没有明显影响。为了证实USP9x调节SOX2的稳定性，USP9x在细胞中被过度表达。过量表达USP9x导致SOX2以剂量依赖的方式升高，并明显延长了SOX2的半衰期。相反，通过shRNA敲低USP9x或通过WP1130抑制USP9x的活性可以明显减少SOX2蛋白，但不包括其mRNA水平。此外，加入蛋白酶体抑制剂MG132可逆转SOX2的减少。

研究结论：USP9x特异性地稳定了细胞中的SOX2。

5.USP9x与SOX2相互作用并使其去泛素化

        为了证明USP9x与SOX2相互作用并调节其泛素化。作者探究外源性SOX2和内源性USP9x之间或外源性SOX2和外源性USP9x之间的相互作用。USP9x和SOX2很容易相互共免疫沉淀。另一方面，在骨肉瘤细胞中观察到USP9x和SOX2的共定位。接下来，作者研究了USP9x是否能调节SOX2的泛素化。正如预期的那样，敲低USP9x增加了细胞中SOX2的泛素化，而USP9x的异位表达减少了SOX2的K48-而不是K63-泛素化。

研究结论：USP9x确实调节了细胞中SOX2的泛素化

6.NGA在细胞中与USP9x相互作用     

        已经证明USP9x是SOX2的 DUB，作者认为NGA可以直接与细胞中的USP9x相互作用。为此，进行了CETSA测定。NGA增加了USP9x在不同温度下的热稳定性。此外，NGA对USP9x热稳定性的影响呈剂量依赖性。该数据表明NGA直接与细胞中的USP9x相互作用。

        随后作者进行分子对接以探索NGA与USP9x之间的结合机制。结果表明，NGA 与Ub的C端尾部可占据的相同子口袋结合结合，这与化合物WP1130不同。据报道，WP1130 通过与半胱氨酸形成可逆共价加合物来阻断USP9x活性。残留 Tyr 1949、Asp1685 和 Gln1796 与NGA形成极性相互作用。

研究结论：NGA的抑制机制可能是通过Ub的阻断来实现的

7.USP9x的敲低诱导骨肉瘤细胞增殖减少

        作者已经证明NGA可以通过直接抑制USP9x来调节SOX2的稳定性。作者接下来试图确定USP9x在骨肉瘤中的作用。对USP9x的敲低明显抑制了骨肉瘤细胞的增殖。流式细胞仪分析显示，敲低USP9x部分阻断了G2/M期的细胞。与这些结果一致，敲低USP9x也抑制了骨肉瘤细胞的集落形成。另一方面，在USP9x敲低的细胞中重新引入SOX2可以逆转USP9x敲低引起的对集落形成的抑制。

研究结论：USP9x在骨肉瘤细胞中发挥着致癌作用。

8.敲低USP9x可抑制骨肉瘤细胞在体内的增殖     

        为了研究USP9x敲低在体内的抗肿瘤效果，建立了一个异种移植的裸鼠模型，皮下接种USP9x敲低的143B细胞。与对照组相比，USP9x的敲低明显减少了肿瘤的大小和重量。与对照组相比，免疫组织化学检测显示，USP9x沉默组有较高的凋亡细胞百分比，较低的增殖细胞百分比和较低的SOX2蛋白水平。

研究结论：敲低USP9x后，体内的SOX2减少，抑制了骨肉瘤细胞的增殖。

结论与讨论

        综上所述，作者证明了USP9x可以在骨肉瘤细胞中去泛素化并稳定SOX2，并且USP9x是治疗骨肉瘤的一个新的治疗靶点。NGA是一种新的有前景的USP9x抑制剂，可用于治疗骨肉瘤。由于SOX2参与调控胚胎干细胞和其他癌症干细胞, USP9x/SOX2轴的发现可能比骨肉瘤治疗有更重要的意义。

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原文链接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.10.015